153-2012-0258
前不久，宾夕法尼亚医学院研究团队在Nature Medicine杂志上发表了一篇题为“Antigen-independent activation enhances the efficacy of 4-1BB-costimulated CD22 CAR T cells”的研究性论文。该研究表明，在给T细胞设计CAR时，更短的连接子（linker）可以使T细胞更好地激活，并在临床前研究中大幅提高了治疗效果。
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞），是一种通过基因工程产生人工T细胞受体的T细胞，它被设计成能使T细胞具有靶向特定蛋白的能力，能直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活，从而更有效地靶向和消灭癌细胞。CAR无疑是CAR-T细胞策略的灵魂所在，其结构设计对其功能有着至关重要的影响。
目前，CAR的模块化设计主要包括有四个主要部分，分别是抗原结合域、铰链（Hinge）、跨膜结构域和胞内信号结构域，每一种组件都有其独特的功能。
其中，CAR的抗原结合域传统上是由可变重链（VH）、可变轻（VL）链及两者之间的连接子（linker）形成的单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）。CAR以抗体的scFv识别肿瘤抗原，从而实现独立于主要组织相容性复合物（MHC）的T细胞活化，scFv序列也是CAR-T研发中的核心技术。此外，胞内结构域通常包括激活区（信号转导结构域）、一个或多个共刺激域。
CAR结构（图片来源：Nature Reviews Clinical Oncology）
宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院血液学-肿瘤学部门的助理教授和淋巴瘤项目的科学主任，同时也是这一研究论文的共同通讯作者的Marco Ruella博士表示：“几种氨基酸的微小差异就会对患者产生巨大的影响。当我们将连接子上缩短15个氨基酸时，CAR的两个抗体可变区片段则更轻易地粘在一起，从而预先激活CAR - T细胞。”
目前，美国FDA已经批准上市5款CAR-T细胞产品，分别为诺华的CAR-T疗法Kymriah、吉利德/Kite的Yescarta和Tecartus，百时美施贵宝（BMS）的Breyanzi和BMS/蓝鸟生物的Abecma，用于白血病、各类复发难治性淋巴瘤以及复发难治性多发性骨髓瘤领域。
而目前这些批准上市的CAR-T细胞中，除Abecma靶向BCMA外，其余均以CD19为靶点。不仅如此，在大多数临床候选产品中，这两个靶点也占据了绝对的热门位置。
血液肿瘤细胞疗法热门靶点Top10（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）
然而，由宾夕法尼亚大学与诺华公司合作开发、并已经被批准用于治疗患有复发/难治性急性淋巴细胞白血病（r/r ALL）儿童和年轻成年患者的CD19 CAR-T 细胞Kymriah的长期随访结果却显示，有相当一部分达到缓解的患者最终复发，这通常在白血病细胞失去CD19抗原的表达，逃避了免疫系统的监控时会发生。因此，宾夕法尼亚州和其他地区的研究人员已经为这类患者开发了第二种方法：靶向CD22抗原的CAR-T细胞。
CD22是Siglecs家族的成员之一，限制性地表达于成熟B细胞和大多数恶性B淋巴瘤细胞表面，同时也是B细胞表面抑制性辅助受体之一，与B细胞的发展、分化和功能密切相关。目前，CD22也是B细胞恶性肿瘤治疗的热门靶点之一，尤其从上图中不难看出，2019年至2020年，靶向CD22的细胞疗法数量几乎翻了一番。
在宾夕法尼亚大学儿童医院进行的两项临床先导研究对患有r/r ALL的6例儿童和3例成人患者进行了CD22 CAR-T细胞治疗，结果显示总体临床反应较差。令人惊讶的是，这些发现与美国国家癌症研究所（NCI）进行的类似试验的积极结果并不一致。
研究小组进一步研究，发现两种治疗之间的唯一区别是单链可变片段的长度。NCI 使用的CAR的长度为5个氨基酸，而宾夕法尼亚大学儿童医院试验所用的CAR的长度为20个氨基酸。
因此，宾大团队与诺华合作，构建了一个新的基于共刺激分子4-1BB的CD22 CAR-T细胞，该细胞具有较短的接头（ linker ），并将其与先前的CAR在小鼠和人类细胞研究中进行了比较。
长CD22 CAR与短CD22 CAR结构 （图片来源：Nature Medicine）
研究结果表明，CAR结构上较短的接头实际上在预激活CAR-T细胞方面更成功，其不需要与抗原结合就能够激活T细胞，从而使它们对B细胞的反应和随后的抗肿瘤活性得到改善。
如今，大多数CAR都配备了两个共刺激信号之一：CD28或4-1BB。研究人员通常认为，当T细胞在看到其靶标之前就被预先激活时，它们很容易被耗竭。而结果证明，这种假设仅对CD28刺激的CAR适用，而对更常用的4-1BB刺激的CAR则不适用。事实上，这项研究证明了截然不同的结果，在携带4-1BB共刺激信号的CAR-T细胞中，这种预先激活反而提高了细胞对B细胞的杀伤能力和抗肿瘤活性。
本研究的共同作者之一，来自宾夕法尼亚大学血液肿瘤科的Saar I. Gill博士表示：“这一发现确实颠覆了当前的理论。
同时，这篇论文的第一作者，在宾夕法尼亚大学期间进行了这项研究的Nathan Singh博士表示：“鉴于以前在该领域所显示的情况，这些发现是相当意外的。这一结果强调，即使很小的分子变化也会对这些合成分子的功能产生巨大影响。最令人兴奋的是，这些数据揭示了一个以前从未发现的途径，能有序改善CAR-T细胞疗法的功能。”
基于这些研究的结果，宾大儿童医院与诺华正在合作进行一项新的临床试验，使用具有较短接头的CAR在患有r/r ALL的成年和儿童患者中进行探索。更多的研究也正在进行中，以探索连接子的长度在其他CAR-T细胞中是否也具有重要作用。
突破传统CAR的创新探索
事实上，超越传统的模式的CAR设计一直是CAR-T细胞治疗领域寻求突破的一个重要方向。这对扩展CAR-T细胞更广泛的应用、提高CAR-T细胞安全性、有效性和适用性都具有重要意义和潜力。
2019年12月，在Nature Reviews Clinical Oncology上发表的“Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy”一文中，研究人员正在使用广泛的工程策略来创新设计CAR，旨在解决CAR-T细胞治疗领域面临的主要挑战：包括严重的毒性，肿瘤内的限制转运、浸润和激活，相对欠缺的体内持久性，抗原逃逸和肿瘤异质性，以及制造问题等，并进一步将CAR-T细胞的使用扩展到更广泛的恶性肿瘤中。
在这篇综述报道中，作者例举并讨论了多种正在开发的新型CAR-T细胞产品的创新设计，以增加和扩大这些治疗在不同癌症患者中的临床效益。其中包括克服系统性细胞因子毒性的小分子“On/off 开关”策略、“自杀基因”策略以及克服（on-target/off-tumor）脱靶效应的“逻辑门控”策略等。
示例图：基于小分子“On/off 开关”的CAR
（图片来源：Nature Reviews Clinical Oncology）
2020年7月，Cell上发表题为“Multiple signalingroles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的研究性论文。研究团队通过定量质谱技术，同时定量分析了T细胞受体（T cell receptor, TCR）激活过程中所有CD3链的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)的磷酸化情况。
分析结果发现，唯独一个CD3ε亚群的 ITAM存在单磷酸化的新功能，因此推测或可助力设计新型的CAR-T疗法。研究者将CD3ε胞质结构域整合到第二代CAR中，发现改善了CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
图片来源：cell
CAR结构发展至今已经迭代至第四代，已上市的CAR-T产品Kymriah、Yescarta和Tecartus都使用的是二代CAR。各研究团队目前依然在积极探寻新的方向，超越传统的CAR-T设计，从而逐步突破这一极具潜力的领域的诸多限制。
参考出处：
1.https://medicalxpress.com/news/2021-04-car-cells.html
2.https://www.nature.com/articles/s41591-021-01326-5
3.https://www.nature.com/articles/s41571-019-0297-y
4.https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30883-7?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420308837%3Fshowall%3Dtrue
