基于同一健康（One Health）策略消除狂犬病

1.简介

图1. 2015-2021年中国狂犬病报告病例数及病例分布省份数（来源：Zoonoses）

为了控制狂犬病的流行，2015年，世界卫生组织（WHO）、世界粮农组织（FAO）、国际动物卫生组织（OIE）和全球狂犬病控制联盟（GARC）组成“联合抗击狂犬病”（UAR）合作平台，倡导全球“同一健康”框架，目标是到2030年实现人类狂犬病零死亡。而实现2030年人类狂犬病零死亡目标的关键便是“同一健康”策略，其实质是通过多部门、跨区域、跨学科的合作，包括人类公共卫生机构和动物卫生机构，以实现其目标。主要措施包括：加强顶层设计，构建基于同一健康理念的防控体系；关口前移，确保犬只70%有效免疫覆盖率；加强动物监测，科学评估溢出风险；加快兽用狂犬病疫苗研究及应用；科学普及，促进健康行为等。其中，70%以上的犬只有效免疫覆盖率是全球消除狂犬病战略的核心。本文主要对中国人用狂犬病疫苗发展历程以及相关研究新进展进行了梳理和概括。

2.发展历程

图2.人狂犬病疫苗发展历程

2.1 动物脑组织狂犬病疫苗

由于全国对犬管理加强，50 年代后期狂犬病病例已很少，全国仅有个别省、自治区有病例报告，年发病例为50-400例。人用狂犬病疫苗生产量亦随之减少。1958-1967年，全国仅武汉所、兰州生物制品研究所（简称兰州所）、长春所3个生物制品研究所生产人用狂犬病疫苗。随后，由于养狗失控，狂犬病病例逐年增加，至19世纪80年代每年报告病例可达万例。疫苗需求量供不应求，上海生物制品研究所（简称上海所）、北京所、成都生物制品研究所（简称成都所）相继恢复生产。

1949 年以来，中国Semple疫苗质量不断提高，对预防和降低狂犬病起到了一定作用，但也出现过脑组织引起变态性脑脊髓炎病例，并有免疫失败病例发生的情况。20世纪70年代前，中国的人用狂犬病疫苗有2 种剂型，一种是添加蔗糖、明胶等保护剂制成的冻干制剂，另一种是Semple法生产的含0.50%石碳酸液体制剂。2 种剂型均含有 5%灭活狂犬病病毒羊脑组织，但 Semple 法羊脑组织疫苗不良反应严重，又需要连续注射14针，至20世纪70年代末逐渐被细胞培养的狂犬病疫苗所取代。

2.2 原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗

为解决神经组织（动物脑）狂犬病疫苗接种人体后的神经合并症和效价低问题，中国有关单位于20世纪60年代开始研制原代细胞培养人用狂犬病疫苗。

2.2.1 原制加佐剂地鼠肾细胞疫苗

1965年，武汉所林放涛等即开始研究用 PHK 细胞培养狂犬病病毒，并成功培育出aG株。经过多次传代和实验，aG株在豚鼠脑和PHK细胞上生长稳定，被确定为疫苗株。其实武汉所早期计划用 aG 株生产减毒活疫苗，但因安全问题，于1972 年改为生产灭活疫苗，并成立狂犬病灭活疫苗研究课题，由卢孝曾任组长。20世纪60年代，长春所褚菊仁、兰州所梁名奕及卫生部药品生物制品检定所（中国药品生物制品检定所前身）俞永新等先后参加协作共同研制，经过15年成功研发出原制加佐剂PHK细胞灭活疫苗。该疫苗于1980年开始生产和应用，年产量已超过100万剂，总体预防效果良好。但存在一些免疫失败案例，原因之一是抗原量偏低，疫苗效价只有1.3 IU/剂，不符合 WHO 标准(≥2.5 IU/剂）。中国狂犬病细胞疫苗取得成功，得到国际同行的高度重视。1984 年林放涛、卢孝曾应邀参加南斯拉夫国际狂犬病疫苗会议并进行相关报告，其还得到了与会代表国际著名狂犬病专家 WIKTOR、SUREAU 和 BEAR 等的高度赞扬。

2.2.2 浓缩佐剂地鼠肾细胞疫苗

1993年，我国原卫生部决定生产疫苗效价≥2.5 IU/剂的浓缩或纯化佐剂疫苗，替代未经浓缩的佐剂疫苗，以提高疫苗质量。随后各生产单位开始大量生产浓缩佐剂疫苗。但由于未纯化，该类疫苗含有一定杂蛋白，不良反应增强。陈学奎等以豚鼠为实验动物模型，将PHK细胞狂犬病浓缩疫苗成品致敏豚鼠后，以疫苗内不同成份静脉注射，结果证实，PHK细胞成份是引起过敏重要物质，过敏严重程度随制品浓缩倍数增大而增大。

2.2.3 浓缩纯化佐剂地鼠肾细胞疫苗

由于人用浓缩狂犬疫苗效果不稳定、不良反应大，自2000年10月1日起，我国停止生产人用浓缩狂犬病疫苗，并注销该品种的批准文号。原已投产并合规的浓缩疫苗在2001年9月30日前仍可销售使用，逾期则视为销售假药。因此，国家药监局决定纯化狂犬病疫苗的生产和使用。1998年，辽宁生物技术公司等多家疫苗公司取得纯化佐剂疫苗生产文号。纯化疫苗是在浓缩佐剂疫苗原生产工艺基础上，对病毒收获液先浓缩再纯化。虽然在3或5剂完全免疫后的中和抗体阳转率为100%， 但当时监管部门没有要求生产企业提供免疫后10-14 d GMT 数据，所以对这种疫苗早期抗体应答情况不清。林海祥等通过小鼠实验证实加铝佐剂疫苗免疫后4d和7d中和抗体滴度明显低于不含铝佐剂疫苗免疫后抗体水平。因此，有必要研制无佐剂纯化疫苗。

2.2.4 浓缩纯化无佐剂地鼠肾细胞疫苗

2000年后，河南普新生物工程有限公司（现改名为“河南远大生物制药有限公司”）率先生产无佐剂人用狂犬病疫苗，试生产时用1批原液分别添加和不添加 AL(OH)3佐剂制备2种疫苗。选取17-67岁的健康志愿者，按5针法程序进行安全性和有效性观察。结果显示，无佐剂纯化狂犬病疫苗组局部不良反应低于佐剂纯化狂犬病疫苗组，且无佐剂苗免疫后具有快速产生中和抗体的优点。同时，参考国际上所有暴露后免疫用疫苗都是不加佐剂的疫苗，因此中检所多次提出并经国家药品监督管理局同意，决定生产无佐剂狂犬病疫苗替代佐剂疫苗。无佐剂狂犬病疫苗生产工艺与加佐剂狂犬病疫苗类似，不同之处在于半成品配制阶段不加Al(OH)3 佐剂。目前 仍有 2 家疫苗企业在国内生产和销售浓缩纯化无佐剂 PHK 细胞狂犬病疫苗，2019-2021年的批签发量分别为 63 万、 105 万、 64 万人份。

2.3 Vero细胞狂犬病疫苗

Vero细胞被WHO认可并推荐为疫苗生产用细胞基质，其优势在于易传代增殖、可在生物反应器中大规模扩增、能模式化培养和在限定代次内细胞特性保持稳定，受到广大科研工作者和生产人员青睐。中国在开展PHK细胞培养人用狂犬病疫苗升级换代同时，也在紧跟国际前沿，积极开展采用Vero细胞进行狂犬病疫苗的研发和生产。在中国，可在Vero细胞上生产狂犬病疫苗的疫苗株有aG、CTN-1、PV和PM株等。

2.3.1 用aG株生产的Vero细胞疫苗

20 世纪 90年代前后，李宏玲、曾蓉芳、顾悦翔等曾经用aG株在Vero细胞上传代适应，结果显示aG株在Vero细胞上的病毒滴度可以满足疫苗生产需要。1990 年，上海所曾蓉芳等报告用 aG株在 Vero细胞适应后获得高滴度的RFD株。1997年，曾蓉芳等又报告在生物反应器内用Vero细胞培养 RFD株获得高滴度狂犬病病毒，病毒滴度可达6.0-8.0lgLD50/mL，病毒原液纯化后得到狂犬病疫苗，小量试制工艺基本可行。2014年，吴金妍等报告了这项工作的后续，2003-2005年开展的临床试验结果显示，与对照组相比，试验组不良反应发生率和中和抗体阳转率差异无统计学意义（r>0.05）。这项研究临床结果比较理想，但未见该疫苗后续上市报道。1992年，长春所顾悦翔等报告利用微载体悬浮培养技术在Vero细胞上开展aG株适应工作，但aG株适应较缓慢，没有取得突破性进展。2009年，袁彦宝等获得aG株在Vero细胞的适应株（4aG-V株）。2011年，郭秀侠等报告3aG株在Vero细胞上适应传代成功。经过前后逾30年的技术积累和科研攻关，2021年长春所获得冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）生产批件并开始批签发。

2.3.2 用CTN-1株生产的Vero细胞疫苗

CTN-1株由中检所建株和保存，CTN-1株传代历史如下：1956 年自山东淄博一名死于狂犬病病人脑组织分离到原始病毒，命名为CTN-S1 株，经小鼠脑内连续传代56次后变为固定毒，命名为CTN-M 株；后经人二倍体细胞 KMB- 17连续传代50次，在Vero细胞上 适应30代即为CTN-1株。1989年，李宏玲等开展了CTN-1株在Vero细胞上适应传代的初步探索。1995年，董关木等证实CTN-1株可在Vero细胞上快速适应，病毒滴度可达7.0 lgLD50/mL以上。后又将CTN-1 56代毒种继续在KMB- 17细胞传代至108代，病毒滴度高达6.5-7.0 lgLD50/mL，原计划用于制备人二倍体细胞狂犬病疫苗，但因病毒培养技术和生产条件不足而未成功。石磊泰等首次对中国狂犬病疫苗生产株 CTN-1进行了全基因组序列测定和比对分析。1998-2001 年，沈阳生物工程公司和沈阳安迪生物高科技公司从中检所获得CTN-1毒种后，开始用CTN-1在Vero细胞培养内进行适应和生产工艺研究。2009年，武汉所把450名健康 志愿者随机分为2组，试验组300人接种CTN-1株生产的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞），对照组150人接种进口冻干无佐剂人用狂犬病纯化疫苗，采用5针法免疫程序，观察并记录每针次免疫后局部和全身不良反应，采用快速荧光灶抑制试验（rapidfluorescence focus inhibition test, RFFIT）检测血清中和抗体。结果显示，该冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）具有良好的安全性和有效性，目前该疫苗已于2017 年开始批签发。2018 年，大连雅立峰生物制药有限公司对CTN- 1株生产的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）进行安全性和有效性评价，后该疫苗也于2017年开始批签发。2023年，华兰生物疫苗股份有限公司用CTN-1株生产的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）正式获得药品注册证书。此外，2021年1月，江苏金迪克生物技术股份有限公司用CTN-1株生产的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）完成Ⅲ期临床试验。2022年12月， 广州瑞贝斯药业有限公司用CTN-1株在Vero细胞上培养的冻干人用狂犬病疫苗进入Ⅲ期临床试验。

2.3.3 用其他毒株生产的Vero细胞疫苗  

2.4 人二倍体细胞狂犬病疫苗

2014年，成都康华生物制品股份有限公司创新使用微载体，在生物反应器中规模化生产的二倍体人用狂犬病疫苗在中国获批上市。相对于国外同类产品采用的细胞工厂培养技术，微载体能提高细胞密度和 培养基利用率。生物反应器全自动化控制培养条件及全封闭管路系统，即使不添加抗生素，也能有效控制污染，同时还降低了批间差异，提高了培养规模和效率，更为重要的是，产品质量更稳定、均一、可控。2010年，北京民海生物科技有限公司开始与法国赛诺菲巴斯德公司合作，用PM株和MRC-5细胞生产冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞），经过多年本土化研究和实施，该疫苗已于 2023年9月在中国获批上市。2017-2018年，安徽智飞龙科马生物制药有限公司用PM株在MRC-5细胞上生产的冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）获得临床试验批件。2022年10月，成都所用PM株生产的冻干人用狂犬病疫苗（2BS细胞）开始Ⅲ期临床试验。

2.5 原代鸡胚细胞狂犬病疫苗

2010年以来，深圳卫光生物制品股份有限公司科研人员基于CTN-1株已有成果开展了创新性工作，首先将 CTN-1株在Vero细胞连续10代，收获的毒种在鸡胚上传1代，鸡胚传代收获的毒种再在鸡胚细 胞上进行连续传代。在鸡胚细胞适应性传代过程中，毒株致病性显著下降，传至15代时采用小鼠法检测病毒滴度，动物已无典型狂犬病症状（无动物死亡，无动物出现弓背、耸毛、狂躁不安等症状）。27代后改为乳鼠法及细胞免疫荧光法进行病毒滴度检测。随着在鸡胚细胞上传代次数增加，毒株适应性及稳定性逐步增强，在鸡胚细胞上传至33代时，细胞免疫荧光法检测病毒滴度可达7.0lgLD50/mL 以上，33代毒株定名为CTNCEC25。目前，CTNCEC25 株鸡胚细胞人用狂犬病疫苗正在注册申报中。2017 年，上海青赛生物科技股份有限公司从国外引进Flury株研发鸡胚成纤维细胞人用狂犬病疫苗获得国内临床试验批件，目前 正在开展Ⅲ期临床研究。

图3.四种狂犬疫苗对比（来源：中泰证券研究所）

3.研发新进展

3.1 关于佐剂开发

高效、低毒、安全、廉价的新型狂犬病疫苗佐剂是目前狂犬病疫苗研究的重要方向之一。皮卡佐剂是一种TLR3激动剂，能够激活有效的抗原提呈细胞，如树突状细胞，从而产生更强大的适应性免疫。Kalimuddin等对健康成人进行的II期开放标签随机研究,进一步证实了加速免疫程序(第0d和第3d双剂注射,第7d单剂注射)下皮卡佐剂狂犬病疫苗的安全性和免疫原性。CV8102是一种TLR7/8/RIGI激动剂RNA佐剂。首次人体试验研究显示,CV8102单独或与狂犬 病疫苗联合接种时，主要引起1级或 2级局部或全身反应 ,无相关严重不良反应发生。25-50mgCV8102与狂犬病疫苗联合接种可显著增强狂犬病疫苗的免疫原性。50mgCV8102剂量下,14名受试者中有2人出现严重但自限性的流感样症状。

3.2 关于新型疫苗

近年来狂犬病新型基因工程疫苗研究获得长足进步 ,不断涌现出新型疫苗，且相关临床试验也显示出良好的安全性和免疫原性。

3.2.1 基于mRNA编码的针对抗原的疫苗

2017年在医学权威杂志Lancet上发表了一项研究报告了一种基于鱼精蛋白的mRNA疫苗(CV7201) 在健康成人中的I期临床试验结果。这项首次在健康人群开展的临床研究结果表明，CV7201在使用无针装置免疫时可以诱导产生针对病毒抗原的功能性抗体，但使用带针注射器免疫时不能产生有效的免疫反应。

3.2.2 猴腺病毒载体狂犬病候选疫苗

ChAdO×2RabG是一种用猴腺病毒作载体的狂犬病候选疫苗，2022年一项首次人体研究旨在评估其在健康成人中的安全性和免疫原性。该研究中ChAdO×2RabG显示出可接受的安全性和耐受性,并具有令人鼓舞的免疫原性，支持进一步的临床评估。

3.2.3 新型重组纳米颗粒狂犬病病毒糖蛋白疫苗

2021年，印度研究人员研发了一种新型重组纳米颗粒狂犬病病毒糖蛋白疫苗。随机、对照、多中心、III期临床研究中，800名受试者按2：1的比例随机接种疫苗(第0d、3d、7d接种3剂)和对照疫苗(第0d、3d、7d、14d和28d接种5剂)。结果显示，新型3剂重组狂犬病病毒糖蛋白疫苗进行模拟暴露后预防接种，在安全性和免疫原性方面不劣于WHO通过资格预审的5剂疫苗。

4.结语