刷牙频率对犬牙菌斑、牙结石堆积及牙龈炎的影响

日常刷牙是预防或减少牙菌斑和牙石堆积的金标准，是预防牙周病发展的关键。由于许多宠物主人不喜欢给他的犬刷牙，这项研究是为了确定刷牙的最佳频率。先前关于刷牙对牙龈炎影响的研究表明，每天仔细刷牙和抛光的犬，在4年的时间里牙龈健康状况保持良好。另一项对患有牙龈炎的犬进行的研究中，需要每天刷牙才能恢复并保持牙龈健康。在一项对牙龈健康的犬进行的平行研究中，每隔一天刷牙（EOD）足以维持牙龈健康，但每周刷牙并不能防止牙龈炎的恶化。在一项单独的研究中，EOD刷牙不足以维持牙龈健康。本研究采用一种明确规范的刷牙技术，在随机、对照、双盲的研究设计中，确定不同刷牙频率的有效性差异，以便提供维持牙龈健康所需的最低刷牙频率的建议。

材料与方法

      这项试验中使用的牙刷a是一种“ADA（美国食品与药品管理局）认可”的软毛、平头牙刷，符合ISO（国际标准化组织）20126：2005年关于刷毛硬度和圆头的标准。在4个刷牙小组中，每只动物都有自己的牙刷。每天刷牙一次、EOD、每周刷牙一次、每隔一周刷牙一次（EOW）。刷牙技术符合兽医口腔健康委员会的要求。用自来水润湿牙刷，接触牙冠表面时，刷毛与牙龈边缘呈45°角 ，刷毛指向牙龈。刷牙时，牙刷在牙间横向移动，总共来回刷三次（一个来回为一次）。第四个动作是将刷毛从牙龈刷向牙冠的尖端。在刷牙过程中，轻轻地将牙刷 压在牙齿的颊面上（如果刷毛明显偏斜或弯曲，刷牙压力就会降低）。对12组（口腔两侧各6组）中的每一组牙齿重复刷牙技术：

      上颌：A组：三颗切齿和犬齿；B组：第1-3前臼齿；C组：第4前臼齿和第1-2臼齿。

      下颌：A组：三颗切齿和犬齿；B组：第1-4前臼齿；C组：第1-3臼齿。

      最初的横向刷三次，上面列出的每组牙齿都要刷到。而朝向牙冠尖端的第四次刷牙(纵向刷一次)，每组牙齿分别进行。由于一些牙齿之间的间距，有必要对每颗牙齿而不是每组牙齿进行朝向牙冠尖端方向的第四次刷牙。刷牙时，犬的嘴巴微微张开，防止上颌牙齿与下颌牙齿重叠，这样就可以刷到下颌牙齿。第1天至第28天，在进食后约1小时开始给犬刷牙。使用这种刷牙技术，只对牙齿的颊面进行评分。在这项研究中，没有努力刷舌侧或腭侧，因为尝试刷这些额外的面可能会使牙齿颊面出现不规则的、额外的刷牙划痕，导致犬之间不受控制的变化。参与刷牙程序的3名技术人员，在每个刷牙组中随机分配相同数量的犬，以减少刷牙者间差异的影响。

      本研究使用USDA（美国农业部）认可的实验动物设施中的成年比格犬。该协议已获得Summit Ridge Farms机构动物保护和使用委员会的批准。在第-7天之前，兽医对所有研究犬进行了全面的身体检查。进行清醒状态下的口腔检查，以确定咬合正常，所有要评分的牙齿都存在并完好无损。最初的口腔检查还包括视诊，以确定多根牙齿是否存在明显的齿根分叉暴露。齿根分叉完全暴露的犬（根分叉暴露指数从0到3分为3分）不被纳入本研究。兽医技术人员在研究期间每天观察犬两次，包括根据该设施既定的兽医护理计划评估疼痛或痛苦。从第-8天开始，每只动物每周测一次体重。每天供应一次干粮b，持续约1小时，供应量是为维持每只动物的体重而设计的。从第-7天开始，研究期间每天记录食物消耗量。在整个研究过程中，每天食物配给在早上尽早提供，除了预定进行牙科清洁/评分的日子(第-7天、第0天和第29天)，此时犬在完成牙科评分/洁治程序并从麻醉中恢复后喂食。在这项研究之前，这些犬都没有刷牙。他们都很容易适应被轻轻保定和刷牙。

      在研究期间，所有的动物都保持了良好的健康状态，没有一只动物因为任何原因终止研究。在研究期间，除了2只接受常规再次接种疫苗的犬外，没有给任何动物使用药物（除了用于预定牙科手术的麻醉剂）。在研究期间，犬没有咀嚼类玩具或零食。

      125只犬，包括64只雄性和61只雌性，年龄1-6岁，共5组，每组25只犬。由于研究中使用了大量的犬，不能在同一天对它们进行专业的洁治(第-7天，第0天)或评分(第29天)--“第-7天”和“第0天”的洁治程序和“第29天”的评分程序都是在3天内完成的。

在28天治疗期开始之前，进行7天的预试验阶段。在预试验阶段，给犬称重，并喂以AAFCO（美国饲料控制委员会）批准的成犬维持性干粮饮食。在第-7天，麻醉和气管插管，对每只动物都进行了牙齿洁治和抛光。在第0天，犬再次被麻醉，在再次洁治之前，对牙菌斑、牙结石和牙龈炎指数进行评分；使用牙菌斑显示剂进行最后检查，以确保在第-7天和第0天洁治后，每颗牙的牙菌斑和牙结石指数都为零。在第0天，检查每只犬的口腔有无撕裂伤或非牙龈炎症/溃疡区域。第-7天到第0天的牙菌斑得分作为试验前牙菌斑得分，据此将犬分为5组，以减少各组之间平均牙菌斑得分的差异。

使用预试验阶段的牙菌斑积累数据，根据牙菌斑评分对犬进行排序，然后随机分配到5组中的1组。在整个研究的治疗期间(包括0到28天)，所有的犬都被给予相同的饮食。将5组犬随机分为：不刷牙对照组、EOW（每隔一周）刷牙1次组、每周刷牙1次组、EOD（每隔一天）刷牙1次组、每天刷牙1次组。在第29天，在麻醉下对菌斑、牙龈炎和牙结石进行评分，并再次检查每只动物的口腔是否有撕裂伤或非牙龈炎症/溃疡区域的证据。

在第-7、0和29天进行牙齿评分和洁治，每只犬在气管插管前静脉注射1%丙泊酚6.0 mg/kg，然后使用异氟烷c维持全身麻醉。每只犬在给与丙泊酚和异氟烷之前皮下注射阿托品(第0天每只犬剂量为0.54毫克，第29天每只犬皮下注射阿托品0.27毫克)。

评分的牙齿是VOHC推荐的牙齿，包括上颌第三切齿03（I3）、犬齿（04）、第三前臼齿07（P3）、第四前臼齿08（P4）、第一臼齿09（M1）和 下颌犬齿（04）、第三前臼齿07（P3）、第四前臼齿08（P4）、第一臼齿09（M1）牙齿的颊面。牙科评分是由兽医技术人员进行的，他们接受过VOHC（兽医口腔健康委员会）认证的牙科评分员在犬身上进行的牙科评分技术培训，并且随后在根据VOHC（兽医口腔健康委员会）协议进行的许多牙科试验中对牙菌斑、牙结石和牙龈炎进行评分。评分人员不参与将动物分配给研究组，也不参与饲喂或刷牙程序。为了便于评分，在研究开始前，每只犬都用一个五位数的数字进行识别。身份号码与分组分配没有相关性。

      对于在第29天进行的牙科评分程序，每只犬都是按照研究主管提供的随机数字顺序选择的，并将犬带到由一名技术人员（而不是执行牙科评分程序的2名技术人员）进行评分的房间。

       第29天，每天刷牙组的犬自上次刷牙后的时间不少于20小时。如果试验继续进行的话，第29天也会对那些不太经常刷牙的犬进行评分，尽量接近下一次刷牙的时间。

      在第0天和第29天，由一名技术员对牙龈炎进行评分。  第0天，在洁牙和抛光之前，对被评估牙齿进行牙龈炎评分。第29天，由同一名技术人员在牙龈炎评分后进行牙结石堆积评分。在第0天和第29天，第二名技术人员在涂抹牙菌斑显示剂并冲洗后对牙菌斑进行评分。第二名评分技术人员不知道第一名技术人员记录的牙龈炎或牙结石分数，反之亦然。在第29天，对牙龈炎、牙结石和牙菌斑进行评分，并再次检查每只犬的口腔是否有撕裂伤或非牙龈炎症/溃疡区域。这项研究中使用的犬以前没有刷过牙，也没有努力使犬适应在第0天之前刷牙。所有随机分配到刷牙组的犬都乐于接受刷牙。

在第0天和第29天评估牙龈炎。按照先前报道的牙龈炎指数，根据改良的牙龈指数(MGI)对牙龈炎进行评分。6牙齿评分的总和除以评估的牙齿数量(18)，以获得该犬的全口平均牙龈炎评分。计算各组犬全口MGI评分的平均值，并进行统计分析。

洁治和抛光后，第0天的牙结石评分被假定为零，并在第0天使用了牙菌斑显示剂后，证实了牙菌斑评分为0。第29天也对牙结石进行了评分。每颗牙齿在评估前都先风干，并使用前面描述的改良方法进行定量评分，下表是根据整个牙冠的结石覆盖率对每颗牙齿进行评分。6牙齿评分的总和除以评估的牙齿数量(18)，以获得每只动物的全口平均牙结石评分。

在第0天和第29天评估牙菌斑形成情况。使用先前报道的改良牙菌斑指数来评估牙菌斑，除了将牙齿在视觉上水平地分成对半的牙龈侧和咬合侧两部分，并且仅对占牙龈表面一半的牙菌斑的牙冠表面覆盖率（%）和牙菌斑厚度进行评分。在牙齿上轻轻喷洒一种显示剂(2%伊红)，并用自来水轻轻冲洗掉多余部分，然后评估牙菌斑的覆盖率和厚度。通过覆盖率和厚度得分的乘积获得每个牙齿的总牙菌斑得分。牙齿评分的总和除以评估的牙齿数量，得到每只犬的全口平均牙菌斑评分。根据下表对牙菌斑形成进行评分。计算一组所有犬的牙菌斑指数得分的平均值，并进行统计分析。

计算所有研究组的体重和食物消耗量、第0天和第29天的牙龈炎、以及第29天的牙菌斑和牙石（牙菌斑和牙石得分在第0天被确认为0）的平均值、平均值标准误差和标准差。牙科参数(菌斑、牙龈炎、牙石)的统计评估采用学生t检验（Student t-tests），比较刷牙组和对照组(未刷牙)的结果。P值<0.05为显著。

与对照组相比，每天刷牙或EOD刷牙的犬在第29天的平均牙菌斑评分显著降低（两组均P<0.01）（表1，图1）。每天刷牙的犬，平均口腔牙菌斑分数比对照组的犬低37％。EOD刷牙的犬，平均口腔牙菌斑分数比对照犬低25％。每周刷牙的犬，比不刷牙的对照组的犬低10％，而EOW刷牙的犬，牙菌斑平均分数比对照组高2％。后2组牙菌斑评分与对照组相比无显着性差异。记录数据的绘图显示，刷牙频率与刷牙效果之间呈线性关系(R2=0.98)[图4]。

图1显示治疗组和对照组从第0天(评分=0)到第28天牙菌斑的评分变化。☆=统计学上有显著差异（P < 0.01）

与对照组相比，每天刷牙、EOD刷牙或每周刷牙的犬、在29天的平均牙结石评分显著降低（P <0.01）（表1，图2）。在第29天，每天刷牙、EOD刷牙和每周刷牙的平均口腔牙结石评分分别比对照组低80%、62%和23%。EOW刷牙组的平均牙结石评分比对照组低10%，但差异不显著。记录数据的绘图显示刷牙频率与刷牙效果之间呈线性关系(R2=0.99)[图4]。

图2 显示治疗组和对照组从第0天(评分=0)到第28天牙结石的评分变化。☆=统计学上有显著差异（P < 0.01）

第0天的平均牙龈指数评分很低(在0-4的范围内为0.50-0.67，表1)，这是预试验时(第-7天)已进行牙齿洁治的结果，并且在第0天各组之间没有显著差异(表1，图3)。与对照组相比，每天刷牙或EOD刷牙的犬在第29天的平均牙龈炎评分显著降低(P < 0.01)。在第29天，每天刷牙组和每隔一天刷牙组的犬，平均牙龈炎评分分别比对照组低62 %和14 %。

图3 显示治疗组和对照组从第0天(评分=0)到第28天牙龈炎的评分变化。在第0天，牙龈炎评分不一定是零。☆=统计学上有显著差异（P < 0.01）

图4 平均牙菌斑和牙结石评分的趋势线。□=统计学上有显著差异（P < 0.01）

表1 刷牙频率对犬牙菌斑、牙结石和牙龈炎评分的影响。

在第0天或第29天的检查中，没有观察到任何犬的口腔撕裂伤、溃疡或非牙龈炎症。

      在以前的研究中，关于对犬使用的特定刷牙技术的细节报道很少。人类的刷牙技术被设计用来清洁一组牙齿，这些牙齿的高度一致，而且在牙冠的大部分高度上几乎没有间隙。这项研究中描述的技术是VOHC成员讨论的结果，目的是开发一种可以可靠地用于不同刷牙者在不同位置对犬进行试验的技术，因此推荐了特定的来回动作次数、确定的刷毛角度、特定的牙齿分组，用特定的牙刷，观察刷毛弯曲情况，以指示施加的压力。为了避免不相关的刷牙，在这项研究中，没有尝试刷牙的舌面或腭面，尽管刷牙的腭面和舌面被推荐作为常规口腔卫生程序的一部分。这里使用的VOHC技术是基于ADA批准的“改良Bass技术”，该技术从刷毛以45°角指向牙龈边缘开始，进行来回运动，最后以扫向牙冠方向结束。

      在一项对比格犬的研究中，它们的牙齿每天至少刷牙、用牙线和抛光一次，以确保没有菌斑存在，并在4年后将其口腔与对照组的犬进行比较，发现日常口腔保健犬的牙周健康状况良好，而对照组的犬患有严重的牙周病。每天对所有牙齿表面进行抛光1次，只有在有专职的工作人员和愿意迅速适应日常口腔卫生的犬的研究群体中才是可行的。在一项研究中，犬接受了训练，允许将橡皮筋放入它们的嘴里，以便在日常牙菌斑显露和清洁过程中保持嘴巴张开。我们的研究也在实验室环境中对配合的比格犬进行，从而使得处理和刷牙的工作量最小。

       虽然每天刷牙本身并不能保证清除所有的牙菌斑，但它被认为是人类日常口腔卫生的金标准。本研究表明，采用标准刷牙程序时，刷牙频率与刷牙效果之间存在着一定的关系，即刷牙对牙菌斑和牙结石的积累率有一定的影响。先前很少有报告研究不同刷牙频率对犬的影响。EOD刷牙不能保持犬牙龈临床健康。在一系列研究中，临床健康牙龈或患有牙龈炎的比格犬每天、每隔一天或每周刷牙一次，持续24周。在研究开始时牙龈健康的犬中，EOD刷牙 (3次/周)足以维持牙龈健康。对于患有牙龈炎的犬(经过专业清洁，每天刷牙8周，然后在刷牙试验开始前的4周内不提供口腔保健)，每天刷牙需要在24周内恢复并保持牙龈的健康状态。

       越频繁的刷牙在延缓牙菌斑和牙石堆积方面越有效，因为刷牙的目的是对牙齿表面产生机械清洁效果。由于第29天评分的时间被安排得尽可能接近下一次刷牙的时间，所以刷牙频率更低的犬有更长的时间积累牙菌斑和牙结石。因此，牙菌斑和牙结石积累较多也就不足为奇了。

      我们的结果表明，刷牙对牙结石的影响大于对牙菌斑的影响。这并不奇怪，因为牙菌斑每天都会重新形成，因此，当牙齿在最后一次刷牙后没有立即评分时，就会出现一些牙菌斑。在这项研究中，牙齿在最后一次刷牙后至少20小时以后进行评分。牙结石需要2-3天后才能形成，因此更频繁的刷牙，特别是每天或每隔一天刷牙，会在早期中断唾液和饮食来源的碳酸钙和磷酸钙的沉积，这时可以通过刷牙去除。一旦出现临床上明显的牙结石，就需要通过牙齿洁治术去除。这里提出的结果表明，当口腔保健的频率低于EOD时，犬的牙结石会逐渐增加。

      给犬刷牙次数越频繁，牙龈炎评分就越低。除了在第-7天牙齿洁治外，在预试验阶段开始时，本研究没有尝试对犬进行预处理，以在第0天获得最佳的牙龈健康。结果是，有些犬在第0天有轻微的牙龈炎（在0-4数值范围内，所有组的牙龈指数平均得分小于1）。由于第0天的牙龈评分存在差异，本研究中对牙龈炎数据的分析时，需要比较第0天和第29天牙龈炎评分的差异。尽管研究结果显示，与不刷牙相比，每天刷牙的牙龈炎平均得分降低了62%，EOD刷牙的平均牙龈炎得分降低了33%，但从本研究获得的数据来看，这种变化的临床意义并不明显，因为第0天的平均牙龈炎评分较低。

      在一项为期21个月的研究中，与不咀嚼的对照组相比，喂食口腔卫生咀嚼片，在短期内可有效减少牙菌斑和牙结石的积累，在21个月时，对照组的牙龈炎初始发展比咀嚼组更迅速和严重，这表明在我们的短期研究中记录的刷牙次数较频繁的组中，中度牙龈炎的减少可能表明长期的临床意义。因为长期试验的成本要高得多，而且牙菌斑和牙结石的积累在短时间内趋于平稳（根据目前使用的评分技术判断），通过较少见的长期研究中报告的短期和长期结果的相关性，可以证明牙菌斑和牙结石堆积的短期试验是合理的。

      在本研究中，在第0天和第29天检查牙龈和非牙龈上皮表面的炎症、撕裂伤和溃疡。虽然有报道称犬刷牙后可能会出现牙龈线性撕裂，但这里报道的结果不仅证实了频繁刷牙的有益效果，还证实了使用符合ADA-ISO标准的软毛牙刷（中等厚度的圆头毛刷）在使用标准的刷牙技术（观察刷牙过程中刷毛的弯曲度作为作用力的决定因素）时，不会损害犬牙龈或其他口腔结构。

      先前的研究表明，不同类型的刷毛（尼龙，直径0.25毫米）或聚乙烯（0.7毫米尖端逐渐变细至0.25毫米）在牙龈组织上刷过，然后对狗进行组织学检查时，会造成不同程度的损害。当在人类和猴子中检查具有不同刷毛特征的刷子的效果时，也有类似的发现。在每种情况下，较硬的刷毛都会造成更大的损坏。刷牙技术（旋转、巴氏或短距离横刷）也可能会导致人类牙龈不同程度的损伤，而短距离横刷方法造成的伤害最大。对犬而言，每天刷牙两次比使用相同的刷牙时间和力度每天刷牙一次更能促进成纤维细胞的增殖。我们的结果表明，在28天后，每天使用符合ADA-ISO标准的牙刷以特定的方式刷牙，不会导致犬口腔其他部位明显的牙龈病变或损伤。这可能至少在一定程度上是由于要求使用刷子的技术人员只将刷子压在牙齿和牙龈组织上，直到刷子的偏转变得可见为止。

      在实验动物环境中为比格犬刷牙，并使用由训练有素的技术人员应用的特定刷牙方案，并使用特定类型的牙刷，在每天或EOD刷牙时，口腔平均牙菌斑和牙结石得评分在统计学上显著降低。刷牙频率越低，效果越差，每周刷牙或EOW刷牙的牙菌斑记录与对照组相比没有显著差异。