【新技术&研究进展】新型检测技术在犬猫主要病原检测中的应用进展

犬猫作为人类伴侣动物,备受人们喜爱,同时在疫病方面受到越来越多的关注。犬瘟热和犬细小病毒病是犬常见的传染病,临床上都表现为高热、呕吐和腹泻等相似症状犬冠状病毒病是一种急性、肠炎型传染病,鉴别诊断与以稀便为主的肠炎疾病相似,尤其区分轮状病毒或细小病毒感染,这些具有相似症状的传染病给诊断带来了困扰。猫杯状病毒常引起猫科动物上呼吸道症状和口腔溃疡,具有较高的感染率,目前还未研制出有效的疫苗,该病原严重威胁猫的健康。引起猫呼吸道疾病的另一常见病原是疱疹病毒,患病猫常出现发热,打喷嚏,鼻、眼中流出分泌物等临床症状,主要威胁仔猫的健康,发病率可达100% 。猫泛白细胞减少症又称猫瘟热,是由细小病毒引起的传染病,幼猫的感染率和死亡率较高,白细胞显著减少是患该病的一个重要特征。此外,大肠杆菌和结核分枝杆菌等引发的细菌病以及弓形虫、旋毛虫、钩端螺旋体等寄生虫病,都是威胁犬猫健康的重要病原。其中,部分疫病为人畜共患病,如狂犬病、弓形虫病和钩端螺旋体病等,存在病原的跨物种传播的风险,对人类公众健康构成了重大威胁。 因此,建立早期快速而准确的检测方法,对控制犬猫疾病的流行具有重要意义。

尽管病原体的分离和鉴定是诊断的金标准,但是某些病原为人畜共患病原体存在安全隐患,因此,在宠物门诊和医院实施较为困难。随着分子生物学诊断技术的进步,相关检测技术不断优化,出现操作简单、灵敏度高、特异性强的新型检测技术, 如实时荧光定量PCR技术、等温扩增技术和基因芯片等核酸检测技术,胶体金免疫层析技术、时间分辨荧光免疫层析技术、荧光微球免疫学检测技术、化学发光免疫分析技术和免疫生物传感器等免疫学检测技术和基于CRISPR/Cas的核酸检测系统等其他新型检测技术,可以满足在多种环境下快速检测病原的需求,本文现针对犬猫主要病原的新型检测技术的应用和研究现状作以下总结概述。

聚合酶链式反应（Polymerase chainreation, PCR）技术主要针对病原基因组高度保守的序列,将微量的核酸分子进行大量扩增,是现代应用较为广泛的病原检测手段之一,但是也存在缺点,需要提取样品DNA,并且检测结果只能依赖于凝胶电泳的定性分析。实时荧光PCR系统可以满足定量分析,目前,已经建立了猫星状病毒、犬流感病毒、犬肝片吸虫、犬钩虫和犬钩端螺旋体等多种常见犬猫病原的实时荧光定量PCR方法。该技术是宠物医疗检测平台的首选技术,但由于检测结果需要依赖于昂贵的仪器设备,且对操作人员有一定要求,所以只能在设备全面的实验室中进行。此外,基于PCR反应原理,衍生出操作简单的等温扩增技术和可实现高通量的基因芯片技术等。

1.1环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(Loopmediated isothermal amplification,LAMP) 是由日本学者Notomi等建立的体外恒温扩增核酸的技术,1h之内即可对靶基因进行高效扩增。

国内外已有利用LAMP技术进行检测的报道。关玮琨等根据犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）VP2基因设计引物建立了LAMP方法,最低检出量为2.1×10-２TCID50,敏感性是PCR技术的100倍,在临床样品进行检测中,其与PCR检测结果符合率达100% 。目前,已有犬细小病毒、犬瘟热病毒和猫泛白细胞减少症病毒等LAMP的检测方法,该技术还运用到犬马鞭毛虫、犬带绦虫、犬孢子虫等多种犬寄生虫病的检测。值得注意的是,LAMP技术已经广泛应用于食源性致病菌的检测,但在犬猫细菌性疾病检测研究较少。相比于普通PCR,LAMP技术只需要简单的恒温水浴即可完成对微量病原的高效扩增,但是还未出现检测犬猫病原的商品化试剂盒。该技术尚有设计引物较难的缺点,引物之间常存在二聚体结构,进而导致结果的假阳性。

1.2重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增 (Recombinase polymerase amplification, RPA) 是Piepenburg等于2006年研发出的核酸等温扩增技术。该技术主要依赖于多种酶和蛋白参与,通过模拟DNA体内扩增,以实现DNA特定区域的指数扩增。

近年来,许多研究工作都报道了应用RPA技术实现对病原快速且灵敏的检测。Wang等针对犬瘟热病毒核衣壳基因设计三种引物和探针,筛选后选出最佳组合,建立RPA快速检测方法,该方法与实时RT-PCR诊断符合率为100%,但相比之下,RPA方法更加省时方便,检测时间为3~12min 。Hu等建立猫冠状病毒的RPA检测方法,在39℃条件下,15min即可特异性检测出该病毒的膜基因,最低检测限为233拷贝。目前,已建立起猫疱疹病毒、狂犬病病毒和犬细小病毒等RPA检测方法,结果均具有较高的灵敏性和特异性,但目前尚未有关于犬猫病原检测的RPA产品完成研发与上市。RPA技术的优势主要在于体外37~42℃恒温扩增,反应时间只需5~20min,可以实现及时准确的检测。该技术还存在不足,如没有专门的软件设计引物和探针,只能通过消耗大量的时间和成本,筛选效果良好的引物和探针。此外,RPA扩增后需要对其进行纯化,否则在琼脂糖凝胶电泳时会导致结果模糊。

1.3基因芯片技术

基因芯片又称DNA微阵列,基于核酸杂交技术原理将靶基因固定到固体支持物上,随后将处理后的样品与靶基因进行特异性结合,以实现对所测样品基因的大规模定量检验,因其高通量的特点而被应用于各个领域。

基因芯片技术不仅能区分多种病原的种属,甚至可以同时跨物种检测,极大的缩短了操作时间。李健等建立了犬冠状病毒、猫冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的三种病毒的基因芯片技术,为病原的快速检测提供了便利。Wu等利用芯片技 术原理同时检测五种犬病毒,这些病毒包括犬瘟热、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒,通过靶向每种病毒的保守基因组区域来实现测定特异性,对临床75个样本进行检测,结果显示与普通PCR技术检测结果的符合率为100%。基因芯片检测病原技术成功的关键在于提高杂交特异性和降低干扰背景,但其检测结果多依赖于专业扫描仪器,成本较高。目前,该技术在犬猫疫病检测方面尚处于实验研究阶段。

由于病原标识性抗原筛选技术、单克隆抗体、多克隆抗体以及重组抗体等生物技术的快速发展,使得基于抗原抗体特异性结合的免疫学诊断技术,以胶体金作为指示剂的层析技术,可以实现对待测 样品的直观快速的检测,已研究出犬细小病毒、犬猫弓形虫 、猫冠状病毒和猫泛白细胞减少症病毒检测试纸条,根据国家兽药基础数据库查询可知,目前已有约13种已经批准上市的犬猫胶体金检测试纸条,由于操作简单,结果只需肉眼观察,被宠物医院和基层单位的现场广泛使用,但胶体金免疫层析试纸条检测病原只能定性或是半定量,且准确性低于PCR技术。在此基础上,新的免疫学检测技术相继出现,如时间分辨免疫分析技术、免疫微球检测技术、化学发光免疫分析技术和免疫生物传感器等。

2.1时间分辨免疫荧光层析技术

时间分辨免疫荧光层析技术(Time-resolved immunochromatographic fluorescent assay,TRIFA)是基于免疫层析和时间分辨荧光分析相结合的定量检测技术,利用荧光的镧系元素或稀土粒子标记抗原或抗体,使抗原抗体在硝酸纤维膜上发生反应,用简单配套的设备来测定荧光强度,从而实现定量分析待测样本中的浓度。

TRIFA技术的主要标记物为镧系元素,因其特殊的发光特性可以有效减低外界荧光和非特异性荧光的干扰,增强检测的灵敏度。Chen等将犬细小病毒抗体与铕(Eu3+) 偶联标记,建立双抗体夹心式的时间分辨免疫层析技术以检测犬细小病 毒的含量,灵敏度达1.15mEu/mL。韩阳瑞等建立了检测弓形虫感染的血清中抗体的时间分辨免疫层析技术,结果通过统计学的分析,显示该方法与ELISA之间具有较好的一致性,且具有足够的精度、分析灵敏度和准确度。我国已有研究人员基于TRIFA技术对犬冠状病毒和猫杯状病毒实现定量检测,但未有针对犬猫病原检测的商品用试剂盒。该技术既保留了胶体金免疫层析技术的反应快速、操作简单的特点,通过荧光技术实现了对试验结果的定量分析,但是实验结果的荧光信号需依赖于配套的仪器设备。

2.2免疫微球分离检测技术

免疫微球分离技术(Immunomagnetic beads separation technology,IMBS）是将磁珠的磁性、响应性和抗原抗体的特异性反应相结合的一项技术,将特异性抗原(或抗体)偶联在磁性微球表面,从而与待检样品的抗体(或抗原)特异性结合,达到分离浓缩的目的。

IMBS主要与其他检测技术相结合以避免样品中的其他成分对检测的干扰,使检测结果更加高效、特异。唐毓等利用表达并纯化的犬细小病毒中VP2基因的重组蛋白作为抗原与纳米微球偶联,建立了一种快速检测犬细小病毒抗体的间接凝 集方法,对临床40份犬血清进行检测,结果显示,不仅检测时间比ELISA用时短,而且与ELISA检测方法的符合率达97%。Chen等将磁珠免疫微球技术和化学发光层析技术相结合建立检测犬血 清中的犬细小病毒抗体的方法,1h通过采集光度即可分析结果,可运用该方法定量检测犬细小病毒抗体的浓度和疫苗免疫效果的评价。相较于传统的免疫学诊断技术，该技术可实现免疫分离与微量富集结合为一体,降低非特异性结合可能性,使检测结果更加高效、特异。使用IMBS进行高效富集的关键在于抗体的特异性和敏感性,但是受到样品基质的复杂性生物干扰,因此,IMBS的应用性能还需要进一步研究。

2.3化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)是以化学发光相关物质为示踪信号标记抗原(或抗体), 利用抗原抗体特异性结合的原理，通过化学发光强度对待测物定量分析。由于发光强度与待测物的浓度呈正相关,可以通过仪器测定发光强度,便可对待测物进行定量分析。

吖啶酯是常见的化学发光物质,其发光效率在1s内即可完成,成本低,适合各种检测机构使用。Gasior等将吖啶酯与二抗(IgG)和SAG2-GRA1-ROP1L嵌合抗原连接起来，建立检测血清中弓形虫特异性抗体的化学发光免疫分析方法,以ROC曲线来分析的IgG CLIA与IgG ELISA测定的诊断价值，使用相同用量的二抗测得AUC(ROC曲线下的面积)的结果分别是0.966和0.985,结果表明,IgG CLIA比IgG ELISA的检测结果更加敏感。Chen等利用犬细小病毒重组蛋白为包被抗原,以吖啶酯标记二抗,建立检测犬细小病毒抗体的CLIA检测方法,1h后即可收集化学发光强度,检测限为0.36ng/mL。杨富强等利用碱性酶对犬瘟热病毒抗原进行标记,以吖啶酯类作为发光底物,设计并发明检测犬瘟热病毒抗体。该方法具有即时 诊断特点,37℃孵育半小时即可。其在灵敏度、稳定性和检测效率上明显优于ELISA测定方法。虽然该技术目前在犬猫病原检测方面未有面向市场的产品，但在2021年完成了第一个动物用化学发光试剂盒的审批注册,该技术不需要外界的激发光源,降低了背景的荧光信号,可以在较宽的线性范围检测极低浓度的样品,具有较高的敏感性,但是其检测结果依赖于专业的实验设备和对操作人员具有一定的要求,因此,在基层推广还是有一定限制。

2.4 免疫生物传感器

生物传感器是分子生物学、电化学、微生物学等多学科相互渗透的新型技术,由分子识别元件即敏感元件(如酶、抗原、细胞器、核酸、细胞受体、生物膜等)和信号转换器(如半导体、光电转换、热敏电阻、压电晶体等)组成,可以与靶标物质发生生化反应并且将其浓度转换为可测量的电信号或光信号,达到定量定性分析的目的。

生物传感器的种类众多,其中免疫生物传感器在病原检测方面是可靠手段,具有特异性、长期稳定性、快速反应性等特点。Jiang等先将硫氨酸在nafion-石墨烯修饰的电极上电聚合形成生物敏感膜,在膜上固定弓形虫特异性抗原,基于双抗体夹心法的原理,构建了一种用于检测弓形虫特异性IgM的新型电化学免疫传感器,结果表明,电流与IgM浓度具有正相关性,检测限为0.016AU/mL(S/N=3)。Kim等设计出检测犬细小病毒的石英晶体微天平生物传感器,将特定抗体嵌合在金涂层的石英晶体表面,通过抗原抗体相结合的频率变化以检测犬细小病毒的含量。该生物传感器具有纳米级的敏感度,通过对临床261份粪便样本分析,结果显示,与PCR相比,具有95.4％的敏感度和98％的特异性。基于免疫学的生物传感器技术具有特异、灵敏、快速的优势,但是也存在缺点,如抗体结合到生物传感器易失活,稳定性较差；非特异性吸附会影响结果的准确性等。目前针对犬猫病原检测的免疫生物传感器方法仍停留在科研实验室阶段，还未出现可应用的商品。

成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)以及相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于古细菌和细菌中的获得性免疫系统,用于抵御外来病毒的入侵。由于CRISPR/Cas系统具有较高特异性和灵敏度,可作为新型的核酸检测平台,其中Cas蛋白作为高特异性的序列识别靶标元件,可以与信号读取方法相结合,进行核酸的定量检测。

基于CRISPR/Cas系统的核酸检测方法主要由三个步骤构成,包括核酸扩增、特异性核酸序列识别以及检测结果读取。Khan等将重组酶介导的扩增技术与CRISPR/Cas13a检测系统相结合,建立快速、特异检测犬细小病毒的荧光报告系统,该系统可在30min内检测到100amol/LCPV-2DNA。该方法具有较高的特异性,通过与其他犬类病毒(犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒)进行检测,结果显示,犬细小病毒的平均荧光值显着更高。CRISPR/Cas系统可以与荧光信号、免疫层析试纸条等方法相结合,便可实现现场操作,可在宠物医院和大型养殖场推广使用。但该技术还存在缺点：如脱靶效应,可能会在检测过程中出现假阳性的结果；RNA 酶广泛存在,可能会使CRISPR检测体系的重要组分向导RNA被降解,影响检测 结果的稳定性。目前该系统在人类疾病领域出现商品化诊断试剂,但在犬猫病原检测研究尚少。

近年来,各种新型检测技术在准确度、灵敏度及操作时间都有跨越式发展,但大多数的核酸检测技术依赖精密甚至昂贵的仪器设备和专业的操作人员,不能在基层大规模普及。鉴于荧光检测系统和侧向流动分析技术可提供一个简单的可视化结果分析,因此可以考虑将多个技术联合使用,发挥各技术的优势,从而实现优势互补以实现快速、敏感的检测。在免疫检测技术中,标记物是影响灵敏度和检测效率的重要因素,与传统的基于金纳米颗粒标记相比,使用彩色微球、量子化、镧系元素和胶体碳等新型材料标记可以进一步提高灵敏度和检测效率,可能使得免疫层析技术更快速、灵敏、准确,在犬猫病原检测方面具有良好的应用前景。尤其是近年来,成熟应用于人类临床医学的化学发光免疫层析技术,已开始在动物疫病检测方面从研究走向市场,未来就需要有条件的企业或科研平台加大科研投入,以促进成果转化,相信在犬猫病原检测方面将会有巨大的市场。

随着科技学技术的发展,检测的智能化、数字化和便携化趋势越来越明显,快速、高效、准确的快速检测方法是犬猫等动物检测的发展趋势。人工智能提供了一个准确分析数据的平台,高分辨率的摄像头和精确的计算能力,可弥补目测带来的不准确性,实现对病原含量客观、精准的阅读,减少操作人员的主观错误判断。

同时,多种病原同步检测技术也是临床检测的发展趋势,尤其是对于处于潜伏期感染的动物,需要在疾病发生早期进行病原筛查,这就需要实现多种病原的多重扩增,对宠物病原来讲,目前仍然是一个挑战。

未来,犬猫等宠物病原检测技术会朝着多种检测技术互相融合、高通量、高灵敏度、高准确度、快速检测、可普及推广及可商品化的方向发展,以便满足在不同检测环境下的快速检测,为犬猫的健康和公共生物安全保驾护航。