新技术推介 | LAMP快检技术平台创建

LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）技术是一种新型核酸扩增技术，具操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强等优点，在疫病检测、食品安全、环境监测等领域具广泛应用前景。然而，其在临床应用中尚存在一些瓶颈问题，如核酸物质快速抽提技术、多重检测体系的创新与优化、结果的快速判定与精准判定、假阳性结果的规避及现场诊断一体化平台设计等，中国检科院科研团队针对以上问题，研究创建了LAMP快检技术平台，以期切实提高LAMP技术的临床适用性，满足基因现场即时诊断需求。

1、创新LAMP检测理念，实现精准鉴别：鉴于LAMP结果判定不具特异性，研究团队借助核酸内切酶酶切技术进行LAMP产物的复核鉴定，分别建立施马伦贝格病毒（SBV）、派琴虫LAMP检测技术，实现了病原鉴别诊断；创建LAMP-RFLP多重检测技术体系，建立了猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重LAMP检测技术，利用特异性酶切位点实现了两种病毒的同步鉴别检测；在内引物poly T区引入外源性酶切位点，建立锦鲤疱疹病毒（KHV）/鲤春病毒血症病毒（SVCV）双重LAMP检测方法，实现了两者的鉴定；并进一步创建流行性造血器官坏死病病毒（EHNV）/传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）/病毒性出血性败血症（VHSV）三重LAMP-RFLP检测技术体系，实现三种靶标同步检测与鉴定。

2、创制LAMP基础反应液及新型染料，打破国外试剂垄断，优化体系设置，提升检测通量：在国内检验检测领域率先引入LAMP快检理念，创制并优化LAMP检测技术体系，成功研制LAMP基础反应液，60min内可实现真鲷虹彩病毒检测，灵敏度与进口试剂相当，填补了国内空白；创新性精简LAMP引物体系，降低冗余引物间相互干扰，创制三种家禽病毒多重LAMP检测方法，引物由12条减至6条；创制新型LAMP染料Dye63，填补国内LAMP核酸指示剂空白，与日本专利产品Calcein相比，敏感性提高10倍，反应延迟时间缩短50%左右，助力实现LAMP闭管检测，有效规避气溶胶污染；创新性将LAMP与微流控芯片技术相结合，建立的6种重要猪病LAMP-CHIP检测法突破了LAMP检测通量低的瓶颈。

图1. 6种猪病LAMP-CHIP检测法芯片图

A. 芯片实图；B. 芯片结构示意图: 每张芯片可同时检测2个样品（样品1扩增区、样品2扩增区），每个样品进行6种猪病毒靶基因的多重检测（12个反应池：6个检测池、2个阳性对照、2个阴性对照及2个空白对照），全封闭设计有效避免交叉污染，1个样本仅需1次加样，每个反应池仅需1.4微升反应液，是单管式LAMP法的1/20。

3、创新研发LAMP配套技术解决方案，致力突破LAMP在即时诊断中的瓶颈问题：自主研发1种新型组织裂解液，更为安全有效，30min内可完成各类临床样本核酸抽提；创制具自主知识产权的核酸快速提取管，摒弃对离心机、移液器等仪器耗材的依赖，一管式操作，于15min内即可获得高纯度核酸物质；针对痰液、拭子等液态样本，自主研发病原体免抽提直扩缓冲液，作用5min即可进行扩增；研制便携式双通道实时荧光二合一恒温分子检测仪M16，获软件证书，可实现检测结果自动上传，根本上解决了LAMP现场诊断缺乏便携式装备的卡脖子问题。

图2. 基于LAMP创新型体系的样品检测流程图

4、成功搭建数十种动物疫病、物种成分、过敏原等集成化快检平台，技术支撑疫情监测、口岸把关及市场监管工作：创制高致病性禽流感、转Bar基因和虾源性成分等30余种陆生动物疫病、水生动物疫病、人畜共患病及物种、转基因和过敏原成分的LAMP检测技术，获多项自主知识产权，完善了我国疫情防控及市场监管快检技术平台的集成与优化。

研究成果形成行标7项，获得发明专利12项，实用新型专利1项；发表高质量论文23篇；研制国家标准物质9项；3项成果获得转化；培训学员千余人次。成果在口岸及国内动物检疫、动植物产品生产和质检企业中进行了推广应用，保障了超2万批次、货值超20亿元动植物产品和食品的质量安全，为保障市场流通领域生物安全和食品安全发挥了重要作用。