科研进展 | 华南农业大学刘健华课题组在细菌耐药机制方面取得新进展

近日，华南农业大学兽医学院刘健华课题组在微生物权威期刊mBio（中科院一区Top期刊）上发表了题为“Promoter regulatory mode evolution enhances the high multidrug resistance of tmexCD1-toprJ1” 的研究论文，揭示了新型耐药基因簇tmexCD1-toprJ1高水平多重耐药性的形成机制。

细菌耐药性是全球公共卫生面临的重大威胁，替加环素是临床上治疗多重耐药肠杆菌所致严重感染的有限药物之一。2020年，该课题组报道了一种位于质粒上的可介导替加环素等药物较高水平耐药的新型多重耐药基因簇tmexCD1-toprJ1，并推测该耐药基因起源于假单胞菌染色体上外排泵基因簇mexCD-oprJ。随后，tmexCD1-toprJ1相关变异体（tmexCD2-toprJ2至tmexCD6-toprJ1b）不断涌现，已构成了一个不断壮大的tmexCD-toprJ耐药基因家族，引起广泛关注。

假单胞菌染色体上的外排泵基因簇mexCD-oprJ因受其上游转录调控因子NfxB的负调控作用而不介导耐药，为探究质粒上的新型耐药基因簇tmexCD1-toprJ1高水平耐药性的形成机制，课题组通过对比多种tmexCD-toprJ变异体与前体基因mexCD-oprJ的转录调控模式和调控机制，发现mexCD-oprJ的转录表达受到局部阻遏蛋白NfxB的强烈抑制作用以及较低活性的启动子PmexC的影响，因而处于沉默状态。然而，tmexCD1-toprJ1基因簇上游的tnfxB1基因编码的TNfxB1蛋白的调控能力较弱，且启动子活性PtmexC1较强，共同导致tmexCD1-toprJ1处于相对较高转录表达水平。相反，在tmexCD3-toprJ1b中，TNfxB3具有一定的转录负调控功能，且PtmexC3启动子活性较弱，导致仅介导较低的耐药水平。

图2 tmexCD-toprJ操纵子及其祖先基因簇mexCD-oprJ的调控模式与功能性进化模型

课题组发现，TNfxB3通过结合外排泵基因启动子区附近48 bp的回文序列发挥转录阻遏功能，TNfxB1与TNfxB3调控作用的差异是由于关键残基的转变（T39R），导致TNfxB1结合DNA的亲和力显著低于TNfxB3蛋白。此外，TNfxB3与DNA间亲和力以及蛋白水平表达量均弱于祖先蛋白NfxB，表明局部调控作用与启动子活性均影响了tmexCD-toprJ的表达水平与耐药功能。

图3 TNfxB3及NfxB蛋白与DNA的亲和力分析及其系统发育关系

本研究阐明了tmexCD1-toprJ1及其变异体的功能和转录调控机制，确证启动子转录活性与调控作用以及外排泵转运药物能力的增强，共同促进了TMexCD1-TOprJ1发挥多重耐药功能，揭示了新型外排泵TMexCD1-TOprJ1独特的功能性进化特征。本研究拓展了耐药基因进化机制的认识，为外排泵抑制剂的研发提供了潜在的靶点。

兽医学院博士生王成真为第一作者，刘健华教授为通讯作者，群体微生物研究中心徐泽凌副教授、香港理工大学陈声教授、生命科学学院洪梅教授也参与了该项工作。该研究依托动物疫病防控全国重点实验室、岭南现代农业科学与技术广东省实验室、农业农村部人畜共患病重点实验室、国家兽医微生物耐药性风险评估实验室和广东省兽药研制与安全评价重点实验室等科研平台，得到了广东省基础与应用基础研究重大项目（2020B0301030007）、国家重点研发计划项目（2022YFC2303900）、广东省本土创新团队项目（2019BT02N054）、岭南现代农业科学与技术广东省实验室开放课题（NT2021006）和广东省优秀青年科研人才国际培养计划（HT202301811-02）等项目的资助。

论文相关信息：https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.00218-24