冠状病毒非结构蛋白2（nonstructural protein 2, nsp2）是病毒基因Orf1ab编码的多聚蛋白在病毒木瓜样蛋白酶作用下，经切割后形成的成熟加工产物。Nsp2在不同冠状病毒中变异程度较大，并且相对其它14-15个非结构蛋白，其生物学功能研究较少。2005年，美国学者Graham等发现beta冠状病毒属成员小鼠肝炎病毒（MHV）或萨斯病毒（SARS-CoV）的nsp2可以被删除而不影响突变病毒在培养细胞的存活，是目前已知可以完整缺失的冠状病毒非结构蛋白基因。但是近20年来，不清楚其它冠状病毒属成员的nsp2对病毒感染是否同样可有可无；更为重要的是，缺失nsp2的冠状病毒突变株的in vivo表型一直没有阐明。因此，nsp2在冠状病毒感染生命周期及与宿主相互作用等过程中发挥的主要作用仍有待解答。近日，华南农业大学兽医学院/浙江大学黄耀伟课题组联合勃林格殷格翰动物保健（中国）有限公司在Autophagy期刊上在线发表题为Enteric coronavirus nsp2 is a virulence determinant that recruits NBR1 for autophagic targeting of TBK1 to diminish the innate immune response的研究工作，以目前危害我国养猪业最严重的肠道冠状病毒病原——alpha冠状病毒属成员猪流行性腹泻病毒（PEDV）为模式病毒，阐析了其nsp2缺失突变株rPEDV-Δnsp2的in vitro及在本动物——猪上的生物学表型，发现突变株对新生仔猪高度致弱，首次提出（或定义）nsp2是肠道冠状病毒的一种毒力决定因子（virulence determinant）。课题组进一步探索和解析了nsp2通过引发细胞自噬，招募货物受体NBR1靶向自噬降解TBK1从而强烈抑制细胞及猪肠道组织先天免疫应答，导致PEDV野毒株引发新生仔猪腹泻的作用机制。
论文链接：
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15548627.2024.2340420
自2014年开展PEDV的研究以来，课题组建立了较为完整的PEDV研究体系，包括“loss-of-function” PEDV反向遗传系统及自制的nsp2抗体。在此基础上，课题组基于一株PEDV强毒，拯救出其完整缺失nsp2基因的突变株rPEDV-Δnsp2，发现nsp2对病毒的复制与存活是非必需的，但突变病毒在培养细胞的生长滴度下降、噬斑大小减少及病毒RNA和结构蛋白合成减慢。比较亲本野毒株rPEDV和rPEDV-Δnsp2对新生仔猪的致病性，发现突变株的致病性（毒力）完全丧失，所感染仔猪无一死亡；并且与野毒株相比，rPEDV-Δnsp2在培养细胞和动物肠道组织诱导更强的I型干扰素与炎症反应，表明nsp2参与宿主的先天免疫反应调控。因此，本研究后续的分子机制研究首先聚焦于先天免疫信号通路，并揭示PEDV nsp2抑制I型干扰素产生的主要靶点为TBK1。PEDV nsp2过表达诱导自噬产生，并招募自噬货物受体NBR1而非其它几种受体（p62, NIX, NDP52, OPTN, TOLLIP等），靶向结合TBK1形成三元复合体导致其被K48多聚泛素化自噬降解，从而抑制I型干扰素及多种干扰素刺激基因的表达。比较rPEDV和rPEDV-Δnsp2感染则得到与nsp2过表达一致的结果，即rPEDV-Δnsp2感染细胞的自噬水平明显减弱，导致其复制与增殖能力下降，TBK1及I型干扰素水平显著高于rPEDV感染，因此在病毒感染背景下同样支持这一分子机制的解释。本研究通过病毒反向遗传学、体内和体外实验、基因过表达/沉默比较、缺失突变病毒/亲本野毒感染比较及在PEDV宿主本动物上的表型试验等多角度、多层面相互验证，初步回答了冠状病毒nsp2研究领域上近20年未解的重要科学问题；为兽医临床上对PEDV这一重要致病病毒的防控挖掘出全新且强力的病毒学靶标及相应的宿主因子；并提出nsp2通过联结自噬与先天免疫两种保守的宿主细胞防御体系发挥双重调控作用，可能是防控冠状病毒新的共性干预靶点，对其它人类与动物冠状病毒的致病机理研究、疫苗研发与防治也提供新的视角和参考价值。华南农业大学兽医学院及岭南现代农业广东省实验室黄耀伟教授及课题组王斌副教授、勃林格殷格翰动物保健（中国）有限公司陈宁博士为该论文的共同通讯作者。浙江大学/华农联合培养博士生焦亚娟、课题组已毕业的赵鹏伟博士和徐令东博士为该论文的共同第一作者。本研究得到浙江大学生命科学研究院徐平龙教授、番文春研究员、浙江大学医学院孙启明教授及复旦大学上海医学院张荣教授等合作者的大力支持。研究工作得到科技部十四五重点研发计划，国家自然科学基金重大研究计划培育项目、青年基金项目及岭南实验室科研项目的资助，后期的独立动物试验（双盲并且高校研究人员不参与）得到勃林格殷格翰动物保健（中国）有限公司的资助和支持。来源：中国动物保健
