听课笔记 | 汪侃博士：《宠物临床微生物检测及耐药性分享》——第十一届中国兽医大会细菌耐药精准诊断与临床合理用药大会

（一）人医临床微生物鉴定技术发展历史

1)V1.0 形态学（since 1880s）

2)V2.0 生化鉴定（since 1980s）

3)V3.0 分子检测（since 2013）

4)V4.0 宏基因组测序（since 2020）

（二）人医临床微生物鉴定技术不断标准化

1.检验前

1)WS/T 640-2018 临床微生物学检验标本的采集和转运

2)WS/T 807-2022 临床微生物培养、鉴定和药敏检测系统的性能验证

3)CNAS-GL-28:2018 临床微生物检验程序验证指南

2.检验中

1)WS/T 805-2022 临床微生物检验基本技术标准

2)WS/T 503-2017 临床微生物实验室血培养操作规范

3)WS/T 497-2017 侵袭性真菌病临床实验室诊断操作指南

4)WS/T 489-2024 尿液标本临床微生物实验室检验操作指南

5)WS/T 499-2024 下呼吸道感染细菌培养操作指南

3.检验后

1)临床微生物检验诊断报告模式专家共识，2016

2)细菌与真菌图片镜检和培养结果报告规范专家共识，2017

（三）当前标准的鉴定技术

根据WS/T 805-2022 临床微生物检验基本技术标准中鉴定技术要求，不管采用何种方法，当进行微生物鉴定时，需要注意不同方法的相应技术要求和方法局限性

可分为：

1)手工法鉴定

如：氧化酶试验、吲哚试验、脲酶试验、触媒试验等。

2)微生物分析仪鉴定

需要注意：切忌不进行初步分类直接使用鉴定卡进行鉴定。

3)质谱仪器法鉴定

需要注意：应知晓所用质谱系统数据库能够覆盖的菌属种类及局限性。

4)血清凝集法鉴定

需要注意：商品化血清试剂盒的局限性。

5)分子检测技术

如：荧光定量PCR、巢式PCR、多重PCR等。需要特别注意避免污染。

6)免疫学检测技术

如：胶体金免疫层析法检测嗜肺军团菌（抗原）、隐球菌（抗原）等。

需要注意：各免疫学方法的检测敏感性与技术特点有所不同。

（四）病原宏基因组检测技术（mNGS）

传统检测为钓鱼式：靶标单一、经验猜测、培养率低

宏基因组测序则是一网打尽：全面覆盖、无需预设、无需培养

病原体宏基因组测序的优点：无需预知、高灵敏、高通量、深度解析

mNGS方法的临床应用难点在于其报告：技术解读、临床解读、数据验证

（五）病例分享

病例1：疑“难”：常规检查排除细菌、病毒性感染，而没有明确怀疑方向时，mNGS检出肾脏钩端螺旋体

病例2：危：流产衣原体引起的肺炎是非常罕见的，但可能导致患者病情危重，单纯的血清学分析或细菌学技术可能会漏诊，宏基因组检测技术可有效助力罕见或未知病原体的检出。

病例3：特“殊”：送检患者深部痰行mNGS，48小时后提示嗜肺军团菌、马尔尼非青霉菌混合感染。

已经形成多部专家共识，其临床价值已经得到了广泛的认可和应用。2024.04 中华预防医学杂志《病原宏基因组高通量测序临床本地化检测规范专家共识》推荐使用人群：

1)重症感染患者：重症指重要脏器衰竭，甚至多脏器功能衰竭，常规检测的同时或在常规检测的基础上，获取相应高质量标本送检mNGS。

2)高度疑似复杂感染：病原学诊断未明确且常规抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测的同时开展mNGS。

3)慢性感染：慢性疾病难以除外感染，抗感染疗效不佳需要明确病因，在完善常规检测的基础上开展mNGS。

4)免疫缺陷患者感染：因为易发生机会致病菌感染和混合感染，且感染病原体复杂多样，考虑应用常规技术检测的同时或在其基础上开展mNGS。

5)不明原因发热患者：考虑感染或不除外感染，规范性经验抗感染治疗无效，考虑应用常规技术检测的同时或在其基础上开展mNGS。

（六）总结

1.病原体宏基因组（mNGS）：利用测序技术和生物信息分析来检测和识别病原微生物的方法。

2.mNGS检测范围：所有已知病原体，还能发现新的病原体。

3.mNGS优点：无需预知、高灵敏、高通量、深度解析

4.做宏基因的时机：考虑感染性疾病，常规病原学检查阴性，经验性抗感染治疗无效时；急危重症、免疫缺陷/低下且不排除感染时。

5.传统微生物病原诊断技术仍然是临床微生物学首选手段，mNGS不能替代传统病原学诊断技术，但可以作为传统手段的有益补充和印证。

（一）人医临床发展历史

1)V1.0 无监管（2004年以前）

2)V2.0 临床监测和治理（2004-2011）

3)V3.0 全面治理策略（2011-2020）

4)V4.0 监测网扩展科研能力提升（2020至今）：“十三五”国家科技重大专项“病原菌耐药性检测、监测关键技术及传播规律研究”

（二）人医临床耐药性检测不断标准化

1.技术标准

1)WS/T 421-2024 抗酵母样真菌药物敏感性试验标准 肉汤稀释法

2)WS/T 411-2024 抗丝状真菌药物敏感性试验标准 肉汤稀释法

3)WS/T 639-2018 抗菌药物敏感性试验的技术要求

2.报告共识

1)常见细菌药物敏感性试验报告规范中国专家共识，2016

2)临床重要耐药菌感染传播防控策略专家共识，2021

3)中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识，2021

4)结核分枝杆菌耐药性检测专家共识，2019

（三）当前标准的药敏检测技术

1.根据WS/T 639-2018《抗菌药物敏感性试验的技术要求》，药敏试验方法包括稀释法（琼脂稀释法和肉汤稀释法）、纸片扩散法、梯度扩散法和自动化仪器法

（1）常规方法的优点：

参考方法

可以测定MIC值

直接提示敏感或耐药

（2）常规方法的缺点：

需要纯培养物，耗时长

操作繁琐

2.新型快速药敏检测技术：通过检测（已存在）的基因组或蛋白质组特征，从而预测抗菌药物的耐药性。

优点：快速

缺点：无法完全替代表型试验（尚未建立公认标准）

（1）技术一：酶免疫层析技术（检测目标物：蛋白）

1)利用抗原抗体免疫层析技术快速检测肠杆菌目细菌中的碳青霉烯酶，是近年发展起来的目前为止以细菌菌落为基础的检测方法中最快速的检测技术。与测序方法相比，酶免疫层析技术检测碳青霉烯酶基因的灵敏度和特异度均在90%以上。

2)酶免疫层析技术具有操作简单、结果容易判读的优点，但缺点是价格较高。各实验室可根据自身条件选择性开展碳青霉烯酶的检测。

（2）技术二：分子检测技术（检测目标物：核酸）

1)碳青霉烯酶分子检测技术可直接快速检测临床标本，如直肠拭子中CRE菌株中的碳青霉烯酶基因，检测时间一般在1h左右，检测灵敏度和特异度可达96%以上。

2)分子检测技术具有快速（可直接从标本中检测）和结果容易判读的优点，但缺点是价格昂贵。各实验室可根据自身条件选择性开展碳青霉烯酶的检测。

3)比如：对于高危患者（免疫抑制患者或骨髓移植患者等），分离CRE菌株碳青霉烯酶基因快速检测，可协助临床尽早启动有针对性的抗感染治疗方案。

（3）技术三：宏基因组测序技术（检测目标物：核酸）

     宏基因组测序的技术原理，相对传统培养法检测周期极大缩短，且让鉴定+预测药敏一体化成为可能。

相比与技术的应用，中国已经基本和国际的技术发展接轨，中国更加需要本土化的中国折点标准。EUCAST于2017年在中国设立了药敏委员会ChiCAST，专家委员来自不同微生物相关领域，包括畜牧兽医学领域，下设不同学组，包括畜牧兽医学组，开始药敏试验标准化，药敏临床研究等工作。已经开始有本土化的研究成果公布，更好的指导中国医生临床用药。

Chinese Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing是欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）欧洲药敏试验委员会（EUCAST）设在中国的药敏委员会，该委员会于 2017 年 3 月成立，委员来自中国、欧洲、美国，专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容（如方法学、折点等）标准化，开展有价值的药敏相关临床研究，对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定，建立抗菌药物敏感性实验教育平台，开展国际间合作与交流，开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学，促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。

国家卫健委每年开展临床微生物检验流程和操作进行标准化的培训，计入继续教育学分。临检中心每年开展微生物检测相关室间质评，对医疗机构的微生物检测能力进行能力考核。在年复一年的培训考核中，微生物检验人员的能力不断提高，帮助行业持续成长。

微生物鉴定尚无统一标准

耐药性检测多依据CLSI标准

国际第三方实验室微生物及敏感性检测方法——IDEXX：采用MALDI-TOF进行微生物检测+梅里埃药敏仪进行敏感性检测，硕腾美国与中国的参考实验室亦采用这套方案。

微生物鉴定多依据形态以及生化鉴定结果

耐药性检测以药敏试验药物种类数量为主要卖点

1.原始样本总体情况

（1）全国范围内30个省市1069家动物医院，样本量5468。

（2）样本类型分布：泌尿道样本占35.3%，呼吸道样本占21.0%，皮肤样本占20.3%，耳道样本占9.8%，无菌体腔液样本占8.8%，其他样本4.7%。

2.菌株分离总体情况

（1）菌株分类：革兰氏阳性菌占59.6%，革兰氏阴性菌占40.4%。

1)肠杆菌目：大肠杆菌占55.7%，变形杆菌占14.9%，克雷伯氏菌属占13.2%，其他占16.2%。

2)葡萄球菌属：假中间葡萄球菌占63.3%，猫葡萄球菌占12.8%，金黄色葡萄球菌占6.9%，其他占17%。

3)其他非肠杆菌目细菌（包括除铜绿假单胞菌外的假单胞菌和除外不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌复合群和嗜麦芽窄食单胞菌的其他非苛养、非发酵葡萄糖的革兰氏阴性杆菌）：假单胞菌属占57.5%，不动杆菌属占29.5%，嗜麦芽窄食单胞菌占8.1%，其他占4.9%。

（2）菌种数量：肠杆菌目1368，葡萄球菌属1126，其他非肠杆菌目细菌1102，肠球菌属502，巴斯德菌属372，链球菌属189，支气管博代氏杆菌80，其他514。

3.多重耐药（MDR）情况

（1）MDR定义：三类或三类以上抗菌药物中，每类均至少有一种药物不敏感。

（2）总MDR比例：52.5%

（3）其中，革兰氏阳性菌耐药率：假单胞菌96.6%，假中间葡萄球菌92.4%，粪肠球菌80.6%；革兰氏阴性菌耐药率：奇异变形杆菌86.8%，大肠埃希菌56.5%，铜绿假单胞菌10.3%。

4.特殊耐药机制

（1）ESBLs（产超广谱β-内酰胺酶的细菌）：即对所有青霉素类、头孢菌素类以及单环β-内酰胺酶抗生素耐药，但其活性能被某些β-内酰胺酶抑制剂药物抑制。

（2）MRS（耐甲氧西林葡萄球菌）：即对所有β-内酰胺类抗生素耐药，包括β-内酰胺酶抑制剂（如阿莫西林/克拉维酸）。

（3）CRE（耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科）：是指对亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南任何一种碳青霉烯类抗生素耐药，或者证实产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。

与公开的往年特殊耐药机制数据比较，犬猫的各特殊耐药机制检出率整体均有上升。