回顾性观察性研究和分析两种不同光生物调节疗法方案联合康复疗法用于治疗犬退行性脊髓病的效果
前言概述
犬退行性脊髓病（DM）是一种进行性成年发作的神经退行性疾病1，特征是后肢进行性广泛性本体感觉性共济失调、不对称性上运动神经元性（UMN）后肢轻瘫，以及缺乏脊椎旁感觉过敏，随后发展成下运动神经元性（LMN）后肢瘫痪，最终发展到前肢2。DM与某些形式的人肌萎缩性侧索硬化症（ALS）在病因、临床症状和疾病进展方面相似，因此，DM可以作为人该病的天然动物模型。超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变和随后的SOD1蛋白质构型改变以及相关的毒性是20%人ALS和大多数犬DM的基因原因3。虽然德牧是最常患DM的品种，但现已知很多品种都可患，整体流行率为0.19%4。
ALS和DM是进行性无法治愈的致命性疾病；因此，临床医生希望通过各种新疗法和临床干预提供整体生活质量，同时也希望能延长患病个体的寿命。然而，虽然ALS病人可以通过内科管理存活相当长一段时间，在此期间疾病缓慢进展直到病人严重虚弱，通常在出现症状后3-5年内因呼吸衰竭死亡；但是当DM犬不能行动和/或大便/小便失禁（虽然通常出血在后肢瘫痪时，但该病各个临床阶段都可能出现2,5）时，通常会进行安乐，这两种情况都给主人在家护理带来很大挑战。犬DM症状的进展在不同品种中非常一致，症状发作的平均年龄为9岁2，虽然更年轻的犬也可能患病6。关于疾病进展- I期：整体感觉性共济失调伴有痉挛性UMN后肢轻瘫；
人们已尝试各种治疗方案来减缓DM的发展和/或缓解症状，但都未取得显著成功7,8。只有每日高强度理疗能带来一些益处。进行每日高强度理疗的DM患犬的存活时间和维持行动能力的时间，都比进行中等理疗或无理疗的犬更久5；本研究中每日高强度理疗指每日至少3-5次步态练习，以及每日3次按摩和人工活动关节或每日水疗。本文发表时，已广泛建议给DM犬理疗，至少可提高动物的生活质量。
光生物调节疗法（PBMt）目前是很多康复方案的一部分，用于治疗兽医中各种疾病9,10。自从Mester最早在1968年发表的研究显示能加快老鼠皮肤切口的愈合速度，随后有大量关于PBMt的随机双盲安慰剂对照研究，结果不一12-15。此时，PBMt背后的光化学和光生物学作用机制已被充分阐明，因此文中我们有意避免谈及PBMt的作用机制原理；感兴趣的读者可参考Hamblin和Demidova的文章15。本研究的目的是分析两种PBMt方案在影响DM从临床症状发作至瘫痪和至安乐时长方面的差异，并将它们的作用与现存历史数据对比。作者收集2003年至2012年所有因怀疑DM转诊至新英格兰一家专业康复机构的犬的病历记录。研究纳入的所有犬主人都在开始康复治疗和/或PBMt前同意治疗，本研究是一项对临床数据的回顾性分析，因此不需要伦理委员会的批准。查看病历记录筛选出符合以下纳入标准的犬：由委员会认证的兽医神经学家转诊或由全科兽医在咨询过委员会认证的兽医神经学家后转诊；体重大于15kg（中型至大型犬）；神经学检查确认存在DM I期临床症状，包括UMN后肢轻瘫、广泛性后肢本体感觉性共济失调和触诊脊柱时缺乏感觉过敏；经过神经学和骨科检查后排除其他疾病；整个康复治疗方案中使用相同PBMt剂量（相同激光仪和治疗参数）。排除标准，除非动物进行过以下一种或多种诊断检查，否则将排除：脊柱核磁共振成像（MRI）用于排除其它病变、密苏里大学动物分子基因实验室（AMGL）进行的SOD1 基因突变检测、死后剖检脊髓组织病理学检查确诊DM。20只犬满足所有纳入标准且不满足所有排除标准，根据犬的PBMt方案将其分为方案A（PTCL-A）组（n=6）和方案B（PTCL-B）组（n=14）。图1描述的为筛选方案。作者从现有文献中选出3个研究“队列”作为“历史数据”与本研究进行对比，3项研究为：Kathmann et al.,5 Polizopoulou et al.,8 and Kanazono et al.16 据作者所知，这些是仅有的包含较大样本数量（DM犬）的行动能力进展和/或存活时间数据的研究。因此，尽管这些研究中动物的基础特征和治疗方式有所不同，但是它们可为疾病进展和存活情况提供一定的历史“预期”。结果和讨论部分有详细对比。
本研究纳入的所有犬均进行一周两次的诊所内康复治疗和家中锻炼。偶尔，两组中均有某些动物只进行一周一次康复治疗。所有犬的诊所内康复治疗均相同，包括PBMt、水下跑步机和其它治疗性运动，表1有列出。所有犬的家中锻炼也相同，也在表1中列出。此外，所有主人都被要求记录犬的每日活动情况。整个治疗过程中，会每周与主人回顾上周记录的活动日志。两组犬的诊所内和家中锻炼均是相同的。根据需要建议给予相应的支持护理，包括辅助装置如背带或行走支持，和保护性靴子、袜子或绷带保护脚。本研究纳入的所有犬均经过被毛进行无创的PBMt治疗；也就是动物不需要剃毛，因为这在诊所中经常不好实施（或者主人不允许剃毛）。治疗时，激光探头直接接触犬被毛和皮肤，激光照射区域为从T3椎体至腰荐连接处的脊柱和左右两侧各5-7cm的脊柱旁肌肉结构。具体PTCL-A和PTCL-B治疗方案见表2.表3为两种组犬的基础信息：性别、毛发长度、体重、治疗开始时年龄和临床症状发作至开始治疗的时间。采用多变量分析（MANOVA）和单变量对比和卡方检验法，分析各组之间差异，当α<0.05时定义为有显著差异。采用Cox回归分析对比各组的临床症状发作至瘫痪至安乐的时间，以及开始治疗至瘫痪至安乐的时间。当α<0.05时，认为有显著差异。此外，使用Kaplan-Meier生存曲线对比PTCL-A和PTCL-B两组临床症状发作到安乐的时间，以及数据充分的一项研究作为对比（Polizopoulou等人）。表1PTCL-A和PTCL-B组犬诊所内和家中康复方案。表2PTCL-A和PTCL-B组犬采用PBMt治疗方案。表3和表4为每只犬的诊断检查和基础信息：性别、毛发长度、体重、开始治疗时年龄和临床症状发作至开始治疗时间。回顾的所有病历记录中均无其它可能导致寿命减少的多系统性疾病（肾上腺皮质技能减退、糖尿病、癌症等）。初始MANOVA分析显示两组之间未分类基础信息之间有显著差异（F(4,15) = 203.522, p < 0.05）。分类基础变量（性别）之间无差异，χ2(1, N= 20) = 0.00，p=1.0，也就是两组种雄性和雌性比例相同。随后单变量对比分析表明只有一个变量两组之间有显著差异：临床症状发作至开始治疗时间。PTCL-B组的临床症状至开始治疗平均时间明显比PTCL-A组更长（F(1,18) = 200.213, p = 0.05）。这里值得注意的是，虽然这个结果是在排除其他变量的基础上对比得出，但正常不会认为延迟治疗时间（任何治疗方式）会有好处。Cox回归分析在控制其他所有基础信息变量的基础上，得出PTCL-B组的“存活”时间更长。临床症状发作至瘫痪的平均时间，PTCL-B组（31.76±12.53个月）明显比PTCL-A组（8.79±1.60个月）更长（Wald统计量=10.503，p<0.05）。临床症状发作至安乐的平均时间，PTCL-B组（38.2±14.67个月）明显比PTCL-A组（11.09±2.68个月）更长（Wald统计量=10.747，p<0.05）。所有犬安乐时均发展至II期DM，完全丧失行动能力。开始治疗至瘫痪的平均时间，PTCL-B组（20.61±9.81个月）明显比PTCL-A组（4.26±0.98个月）更长（Wald统计量=12.828，p<0.05）。开始治疗至安乐的平均时间，PTCL-B组（27.05±12.39个月）明显比PTCL-A组（6.83±2.41个月）更长（Wald统计量=11.607，p<0.05）。虽然不是本研究的主要关注点，但我们发现根据以上分析，存活时间与开始治疗时年龄有勉强显著的正相关性（与临床症状发作至安乐时间p<0.10；与临床症状发作至安乐时间p<0.05；与开始治疗至瘫痪时间p<0.10；与开始治疗至安乐时间p<0.10）。Kaplan-Meier生存分析显示临床症状发作至瘫痪的时间，PTCL-B组明显比PTCL-A组更长（Mantel-Cox对数秩统计量=20.434，p<0.05），也比历史Polizopoulou等人组更长（Mantel-Cox对数秩统计量=16.334，p<0.05）。PTCL-A组和Polizopoulou8等人组的存活时间相似（图2）。文献中，Kathmann和Kanazono报道的数据为：中位存活时间8.36个月（n=9）和症状发作至瘫痪的中位时间为10个月（n=63），都与PTCL-A组相似，分别为11.09个月（n=6）和8.79个月；并且都比PTCL-B组短：38.2个月存活时间和31.76个月至瘫痪（n=14），虽然无法正式对比这些数据。由于本文为回顾性研究、样本量较小和缺乏含有相似参数的历史研究数据，应谨慎对待文中数据分析得出的结论。然而，对这些收集到的数据的分析表明，结合PTCL-B PBMt和高强度康复治疗对推测诊断为DM的犬有明显好处，可以减缓临床症状的发展和提高存活时间。这一结果和现无DM有效治疗方式，以及可能对人ALS有益，都表明未来需要做更多对照研究。生前诊断DM可能会非常困难，很大程度因为其它获得性脊髓疾病（椎间盘疾病、腰荐椎狭窄、脊髓肿瘤）或骨科问题（后肢骨关节炎、前十字韧带损伤等）可能会有很多相似临床症状。年级较大的DM患犬也可能会有其它一种或多种疾病。虽然全面神经学和骨科或许可以区分这些临床症状的一些原因，考虑到有相似临床表现的其他脊髓疾病和骨科问题占据多数，DM很大程度上是在之前介绍的进行性症状的基础上，通过排除这些更常见疾病来诊断的。这是本研究的一个纳入标准。目前，只能通过死后脊髓组织病理学检查确诊DM，组织病理学上显示特征性的轴突和髓鞘变性伴随最严重部位（通常是胸段脊髓1,17）星形胶质增生增加。也可以做其他诊断性检查，包括神经诊断性影像检查、电诊断测试、常规脑脊液分析（DM早期这些检查都正常），和基因检测。基因上，大多数DM犬为SOD1: c.118G>A等位基因的纯合子（虽然一些无其他SOD1错义突变的杂合子犬也会患DM）。虽然基因检测可以证实DM的诊断，但单独基因筛查不足以诊断，因为SOD1突变不是完全显性的。然而，临床中可能因各种原因不会做这些高级诊断检查，包括资源限制和/或主人经济有限。考虑到这些局限之处，作者仅纳入至少做过一种高级诊断检查提示为DM的犬（或至少在做脊柱MRI时排出了其它脊髓疾病）。研究中所有犬缺乏确诊（仅有5只犬做了组织病理学检查）显然是本研究的一个不足之处，可能会影响结果（例如有些犬可能没有DM），未来需要前瞻性研究来克服这个不足之处；然而，诊断缺陷准确反映了动物疑似DM时最常遇到的临床情况。PBMt的基础原理：“光化学激活原则”或Grothuss-Draper定律，表明只有被系统吸收的光才能带来光化学变化19。因此，经皮传递光治疗DM时，应如此设置光参数和PBMt治疗方案，以便在减去损失在被毛、皮肤和肌肉中的光能后，有“足够”的光到达并被脊髓中的神经细胞吸收。Piao等人的研究定量分析了使用安全临床可接受光辐射度经皮照射犬尸体脊髓时，可传递至脊髓的光能。Piao发现皮肤光辐射度与脊髓处测量到的光能呈线性相关，并且接触式照射在大型犬中有更高的传递量20,21。因此，PTCL-B组的脊髓辐射度是PTCL-A组的2.4-4.8倍高，前者皮肤辐射度为1.2-2.4 W/cm2，后者为0.5 W/cm2（见表2）。这个估算忽略了不同波长导致的组织光能损失差异，PTCL-A组使用的是904nm波长，PTCL-B组使用的是980nm波长，也未考虑不同细胞色素C氧化酶吸收22,23特性导致的治疗效果差异。但与两种方案的皮肤辐射度差异相比，这些都是很小的差异。如果数据分析结果真实的话，也就是结合PBMt和高强度康复治疗可以延缓DM犬的临床症状发展和延长存活时间，那么只有PTCL-B组的犬获得这些好处。有可能不同PBMt参数带来的肌肉骨骼治疗效果不同是结果差异的全部原因。然而，由于PTCL-A组使用的PBMt参数已被证明是有效肌肉骨骼疗法24-28，这个解释的可能性很低。更合理的解释是PTCL-B组传递至脊髓的光能足以产生临床效果，而PTCL-A组的不行。值得注意的是，Piao研究中使用的激光与本研究中PTCL-B组使用的相同，并且Piao在脊髓处（T13-L1区域最浅位置）测量的光辐射度，与人急性缺血性中风时使用的相似29-31，三个试验中两个有效。虽然DM时退行性变化遍布整个脊髓白质，通常在胸中段至后段脊髓背侧外侧索处最严重的1,17,32。这里是本研究中所有犬均进行PBMt治疗的区域。文献中已有证据表明PBMt不仅能调节外周神经损伤33,34后的炎症反应，脊髓损伤（SCI）后的炎症反应也可调节35,36。据报道，SCI后立即进行PBMt的益处包括：数据上显著抑制促炎细胞因子和趋化因子基因表达、参与继发损伤的入侵细胞显著减少如巨噬细胞/活化小胶质细胞和T淋巴细胞、星形胶质细胞增生减少、轴突再生和功能显著改善36,38。这些研究表明中枢神经细胞受到损伤时，光能带来益处，改变继发损伤反应和损伤过程的发展。关于经颅PBMt（TPBMt）的研究进一步发现能显著改善实验动物缺血性中风后的神经评分39-41，提高脑创伤后的短期和长期行为功能并减少脑组织丢失41,42。正如前面讨论光传递时提到的一样，在660名病人中进行的有效性和安全性试验表明，TPBMt是一种安全的治疗方式，且在人中风后24小时内进行治疗存在有效趋势29,30。无数研究表明星形胶质细胞核星形胶质细胞和星形胶质细胞谷氨酸转运体（GLT-1；神经胶质细胞再摄入兴奋性氨基酸通道）可能在神经退行性疾病中改变疾病进展和运动神经元（MN）丢失方面起一定作用43-47。星形胶质细胞可通过分泌炎性介质包括一氧化氮和前列腺素E248,49，诱导MN变性，且至少有一项研究表明来自家族性ALS（FALSE）和偶发性ALS（sALS）病人的神经前体细胞源性星形胶质细胞都对MN有毒性，该研究在体外共同培养鼠胚胎干细胞源性MN和来自两个病人的分化星形胶质细胞。据报道，在fALSE和sALSa病人的脊髓中存在萎缩MN时，有发现胶质纤维酸性蛋白（GFAP）-阳性星形胶质细胞的增生增加，并且与DM犬脊髓中轴突丢失和脱髓鞘严重程度相关46,47。Ogawa等人报道在同样这些犬的灰质中发现一种特殊可诱导一氧化氮合成酶（iNOS）的明显表达模式（非T细胞介导的诱导模式），与转基因小鼠50,51和ALS病人中的发现相似52,53。引用之前的报道，也就是星形胶质细胞通过iNOS产生一氧化氮与GLT-1的谷氨酸摄取活性或谷氨酸诱导的兴奋性毒性有关，结合DM犬脊髓中星形胶质细胞的GLT-1表达减少的发现54,55，Ogawa等人总结认为DM时一氧化氮产生和谷氨酸摄取之间可能有相互作用。作者知道至少有四项研究报道PBMt对星形胶质细胞活性的作用。Yang等人发现用PBMt预治疗大鼠皮质星形胶质细胞56，未出现典型的诱导产淀粉样蛋白β和ROS和炎性反应。一项关于帕金森病的猴模型研究表明PBMt对神经胶质反应也有影响57，尤其是星形胶质细胞。Sun等人发现大鼠SCI后采用PBMt治疗脊髓，可抑制GFAP阳性星形胶质细胞和抑制星形胶质细胞的增殖和星形胶质细胞活化相关基因的体外表达。最后，有一项研究专门评估PBMt在ALS59的SOD1转基因鼠模型中的应用。这项研究报道进行激光治疗的那组有虽然短暂但数据上显著的改善。这些数据表明存在运动缺陷的延缓，但这个好处只在疾病早期发现。这项研究发现的小鼠疾病早期运动缺陷延迟出现，与本回顾性研究在犬中的发现一致。而且，与对照组相比，激光治疗组小鼠颈膨大和腰膨大处脊髓中GFAP表达（星形胶质细胞标记）显著减少。作者总结激光可能有抑制脊髓中MN周围星形胶质细胞的作用，继而产生保护作用。未来需要做更多工作，研究DM发病前和疾病进展中星形胶质细胞和神经元之间的相互作用，以及PBMt对这些相互作用的影响；然而，作者认为PBMt可能通过前文提到的相似机制对脊髓中MN产生保护作用。除了PBMt对脊髓的潜在益处，作者还考虑存在其它潜在有益机制，包括辅助治疗性运动的增能作用和预防运动诱导的肌肉疲劳或损伤。最近，低水平激光治疗被用于提高强烈运动时的肌肉性能28,60。各种研究已表明强烈运动时PBMt可介导肌肉中三磷酸腺苷增加并提高肌肉的耐疲劳性60,61。关于小鼠和人的研究显示与对照组相比，运动前用PBMt治疗不同时间都可提高肌肉的耐疲劳性和改善肌肉能量代谢26,27,62-65，而且这个效果可能在年纪更大的小鼠/人中更显著66。更多的研究已经表明PMBt能帮助预防过度运动后的肌肉酸痛、减少运动中的肌肉损伤、加快运动后恢复，还可以通过各种机制促进肌肉损伤愈合25,60,67-69。可检查安乐动物肌肉组织中或其他病患血清肿氧化应激和炎症标志的研究显示，PBMt可加快或解决急性炎症反应和减少肌肉创伤导致的氧化应激27,64,70。作者就本研究中PBMt提出一种或两种可能的作用机制：对脊髓的作用，尤其是在疾病早期对MN保护性作用，通过减少参与脊髓继发损伤的细胞入侵或减少星形胶质细胞增殖，减少星形胶质细胞产生一氧化氮和随后对GLT-1的影响，恢复脊柱附近肌肉细胞能量代谢，和/或减少肌肉疲劳，辅助治疗性运动和帮助运动后恢复。由于缺乏临床验证的有效治疗方式，临床医生通常会采用传统或新颖疗法缓解DM的症状2。最近依达拉奉（Edaravone）被美国食品和药品管理局授予孤儿药资格（(Press Announcement May 5, 2017; fda.gov），很多年来第一个FDA批准的ALS新药。依达拉奉被认为部分通过其自由基清除作用起到神经保护作用71。虽然有关于该药在犬缺血性再灌注损伤中的研究72,73，还没有关于其在治疗犬DM中作用的研究。最近一项研究是关于内源性大麻素变化的，可能是研发治疗犬DM和人ALS的大麻疗法的第一步74。虽然本研究不是前瞻性的，而且样本数量有限以及没有所有犬的死后组织病理学检查，但确实表明结合PTCL-B PBMt和高强度康复治疗能带来有益效果。考虑到缺乏DM有效治疗方式，ALS临床前试验的众多挑战，以及小实验动物模型中取得成功的新型神经保护药物未很好地应用到伴侣动物和人中，应考虑采用PBMt和高强度康复疗法缓解疑似DM犬的临床症状，这也可能是人ALS未来研究的方向。目前，作者正计划一项RDBPC试验来验证PBM对犬DM的治疗效果。研究将包含更大的样本数量，采用更严格的纳入标准，使用虚假激光治疗仪进行安慰剂对照治疗，采用与本文相同的剂量和波长：905nm和980nm，而且会更严格地评估结果。理想的话，这项试验将是多中心性的，前提是每个研究地能够做纳入前标准诊断检查并执行包含康复疗法在内的治疗方案。考虑到本回顾性研究的积极结果，未来这个前瞻性研究中假激光治疗犬可能一段时间后缺乏改善和/或临床症状恶化，应考虑设计成交叉随机实验。最好在整个研究过程中，应定期校正激光仪，以便确保任何仪器经皮肤给予的剂量都与预期剂量相同。作者感谢宠物主人和执业工作人员的支持，以及要求公布这一信息的兽医同事，并致谢对这项工作产生影响的被引用的文献。
