【学术交流】mRNA技术及其在动物疫病研究中的应用进展

mRNA又称信使RNA(messageRNA,mRNA),由DNA为模板转录而来，负责指导胞内蛋白质的合成。mRNA技术是一种将人工合成的mRNA分子引入细胞内，并利用细胞自身的翻译机制将其转录成蛋白质的技术，已有几十年的研究历史。新冠疫情暴发后，Moderna利用该技术仅用了42天即完成了新冠mRNA候选疫苗mRNA-1273的构建和筛选，并于2020年3月获得FDA批准正式开始评估安全性和免疫原性的I期临床试验，试验结果显示该候选株的免疫保护性可达94.1%。2020年12月辉瑞和Moderna分别研制的mRNA疫苗均获得美国食品安全局的紧急使用授权(EUA),成为疫苗史上最快研制上市的疫苗,标志着mRNA技术正式应用到COVID-19临床预防。随着mRNA技术的发展以及在新冠疫情防控中的应用，该技术成为生物医学领域的研究热点，得到了极大的关注，并获得了2023年诺贝尔生理学或医学奖。同时该技术也在动物疫病中进行了应用研究，现就mRNA技术的发展历程，mRNA疫苗的设计、递送及特点，以及其在动物疫病研究中的进展予以综述。

mRNA主要分布在细胞质中，由编码区、上游的5′非编码区和下游的3′非编码区组成，真核生物mRNA分子两端还有5′帽子和3′尾部结构，原核细胞的mRNA一般没有尾部结构。1961年，Brenner及Gross等发现在蛋白质合成过程中，有一种物质与核糖体结合，由此发现了mRNA。到了1975年，有文献报道发现了mRNA的帽子结构(5′端高度甲基化修饰）。1978年，DimitriadisGJ将脂质体包裹的mRNA递送至小鼠淋巴细胞,有了这些前期的基础，Malone在1989年首次提出mRNA疫苗的概念。然而，受mRNA不稳定，易被机体模式识别受体(PRRs)识别并降解等因素的限制，当时的研究更倾向于比较稳定的DNA疫苗，而mRNA的应用研究更偏向于免疫佐剂方向。直到1990年，Wolff等人首次报道使用人工合成的裸mRNA注射到小鼠骨骼肌可促进编码蛋白的表达,证明体外合成mRNA作为信息载体指导体细胞蛋白合成的可行性。2005年，Weissman等人发现使用修饰的外源mRNA可以降低在体内诱导免疫反应并避免快速降解。近年来，随着5′端加帽技术的发展，体外合成mRNA的稳定性、翻译效率得到提高，而机体对RNA的先天免疫反应，RNA的降解速度也相对降低。此外，假尿苷修饰技术、种属密码子的选择和优化、最优化的UTR（非编码区）和多聚A等技术的发展进一步增加了mRNA稳定性。2020年新冠mRNA疫苗获得了EUA认证,证明mRNA疫苗可能成为未来快速应对新发传染病的新手段，也加速了mRNA技术的发展。2023年诺贝尔生理学或医学奖公布，授予匈牙利生物化学家KatalinKarikó和美国医学家DrewWeissman,以表彰他们在核苷碱基修饰方面的发现，从而开发出了有效的mRNA疫苗。

2.1 mRNA疫苗的设计

mRNA技术是一种将人工合成的mRNA分子引入细胞内，并利用细胞自身的翻译机制来将其转录成蛋白质的技术。这其中最难的便是人工合成mRNA分子，合成过程大概分为三步：第一步根据目的基因序列设计mRNA序列，优化其序列并制备重组质粒；第二步对重组质粒进行线性化及加尾；第三步对线性化质粒DNA进行体外转录、加帽及纯化，得到mRNA分子后，再对其进行体外细胞转染和检测。现阶段mRNA技术最成功的应用是mRNA疫苗，其结构和mRNA一样，包括5′端帽子结构-5′UTR（非编码区）-ORF编码区（目的基因序列）-3′UTR（非编码区）-3′端poly(A)尾巴。5′末端添加cap帽子结构可以增强mRNA分子的稳定性。5′端添加cap帽子方法很多，可以通过加帽试剂盒添加，也可以在体外转录的同时添加，即cap结构，DNA模板，T7RNA聚合酶以及核苷酸和修饰的核苷在体外合成mRNA分子，然后将其纯化后便得到mRNA原液，在众多添加cap结构的方法中，这种方法比较快捷方便。位于5′端和3′端的UTR一般选择高表达基因，如人β珠蛋白,因为含有这些UTR的mRNA通常具有高水平的翻译和稳定性。通过高通量筛选合适的UTR序列添加到mRNA质粒上，可以提高mRNA的表达，合理组合5′UTR和3′UTR可以使翻译效率最大化。编码抗原的ORF（开放阅读框）是mRNA中最关键的组成部分，因为它包含了翻译成蛋白质的编码序列。尽管开放阅读框的可塑性不及非编码区，但它可以通过将人体内很少使用的密码子替换为经常出现的密码子来进行优化，当然编码蛋白的氨基酸序列不能改变，这样优化可增加蛋白质翻译。目前有多种poly尾的添加方法，最简单的方法是在PCR扩增目的基因进行质粒线性化的时候在下游引物上增加互补碱基，使得到的目的基因上带有poly尾。mRNA疫苗由这五部分组成的结构不仅增强了mRNA的稳定性，同时提高了mRNA翻译的准确性和效率。之后再将体外转录获得的mRNA原液直接引入目标细胞中，在细胞内完成翻译形成蛋白质。该蛋白质更接近天然构象的蛋白，因为避免了传统蛋白质制备方法中所面临的问题，例如复杂的蛋白质折叠和后续纯化等步骤。

2.2 mRNA疫苗的递送系统

除了mRNA本身外，递送系统也是mRNA疫苗中不可或缺的一部分，因为mRNA必须穿过细胞膜才能到达细胞质内进行抗原蛋白表达。但由于mRNA带有负电荷且分子量较大，容易被核酸酶降解,很难到体内发挥作用，所以就需要一种有效的递送方式来解决这个难题。mRNA递送系统的研发最早可追溯到1989年,主要包括物理和化学两种方式，前者通过电穿孔的方式，使靶组织生物膜表面瞬时形成微孔，让mRNA通过，这种方式操作简单，但由于电击操作的可变因素较多，电脉冲也会对细胞造成一定损害，该方法的应用受到了限制。化学方式中最常用的是脂质纳米颗粒(LNP)递送技术。LNP由4种成分组成，包括可电离的氨基脂质、惰性亲水性聚乙二醇(PEG)-脂质、稳定剂胆固醇和辅助磷脂。这些成分的精确比例可以增强LNP的稳定性，从而促进mRNA复合物的吸收，使得mRNA在准确递送至细胞内的同时也得到准确高效的翻译，从而将抗原递送给抗原递呈细胞刺激机体的体液免疫和细胞免疫应答。在使用LNP时，可电离的氨基脂质可以在低pH下与核酸缩合，促进自组装成病毒大小的颗粒，并将mRNA从内体释放到细胞质，惰性亲水性聚乙二醇(PEG)-脂质可以增加制剂的半衰期，并限制蛋白质和细胞的相互作用，同时稳定剂胆固醇可以填补LNP分子之间的间隙，提高稳定性，并帮助LNP与内体膜融合，辅助磷脂可以支持脂质双层结构。此外，LNP还可以保护mRNA分子不过早被TLR识别，避免先天免疫反应过度激活。由于其简易、模块化和生物兼容性等优势，LNP成为目前最有前途、研究最广泛、进展最快的mRNA递送技术之一。

2.3 mRNA疫苗的独特优势

mRNA疫苗相较于亚单位、灭活病毒和减毒活病毒以及DNA的疫苗等传统疫苗具有高效性、安全性、适应性、无需单独佐剂等优点。

2.3.1 高效性

mRNA疫苗研制速度远快于传统疫苗，是因为其生产过程不需要使用活病毒或细菌，也不需要培养细胞，只需要合成mRNA序列即可。此外，mRNA疫苗可以在短时间内产生特异性免疫反应，是因为它不仅可以激活体液免疫，还可以激活细胞免疫，例如辉瑞和BioNTech共同研发的新冠mRNA疫苗BNT162b2,一次注射就足以引发人体高滴度的中和抗体反应以及CD4辅助T细胞和CD8细胞毒性T细胞反应。这也是mRNA疫苗的关键优势。

2.3.2 安全性

相比传统的疫苗技术，mRNA疫苗不包含活病毒或细菌，因此不会引起感染；无需进入细胞核，直接在细胞质翻译，不存在基因组整合风险。此外，mRNA疫苗在人体内的半衰期较短，仅10min左右,不会在体内长期停留，降低了不良反应的风险。

2.3.3 适应性

mRNA疫苗可以根据病原体的变异来快速更新，以保持其对新型病毒株的有效性。这种灵活性使得mRNA疫苗可以更好地应对新兴病毒和传染病的爆发。

2.3.4 无需单独佐剂

传统疫苗需要添加佐剂以增强免疫反应，但是mRNA疫苗的LNP组分具有佐剂活性，这种LNP驱动的佐剂活性能够激活免疫系统,因此不需要其他单独佐剂。

mRNA技术在动物传染病研究中的应用相对滞后，尚无可临床应用的产品被批准。目前国内外动物传染病mRNA疫苗的研究主要聚焦人兽共患病及几种少数重要动物疫病的病原微生物，主要动物疫病mRNA疫苗的研究进展见表1。

3.1 在狂犬病研究中的应用

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)引起人和所有温血动物的一种接触性传染病，潜伏期较长，病死率可到达100%,犬、猫、人、牛、羊、猪等均易感。RV的G蛋白是中和抗体识别的主要抗原。G蛋白为糖蛋白全长，其中G△TM蛋白为G糖蛋白的膜外部分；Gtrimer蛋白为G糖蛋白的三聚体（模拟病毒表面G蛋白天然构象）；除此之外，M蛋白是RV的膜蛋白，M蛋白可以调控病毒RNA复制及病毒的组装，在病毒装配和出芽过程中起关键作用。目前主要通过疫苗免疫预防和控制该病。现有Rabies疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗等。我国现在使用的VERO细胞或地鼠肾细胞源的Rabies疫苗，均为灭活疫苗，尽管安全、有效，但是需多次接种才能产生足够免疫、生产周期较长且费用高等因素限制了该类疫苗的使用。因此，多个研究团队开展了以mRNA技术为载体的新型狂犬疫苗的研发。SaxenaS等研究人员制造了一种表大RVG蛋白的mRNA疫苗。微小剂量的疫苗能够使小鼠产生类似DNA疫苗引发的细胞免疫和体液免疫反应，小鼠产生了较高水平的中和抗体和足够的免疫保护[32]。张梦玲等分别针对RV的G蛋白，G△TM蛋白、Gtrimer蛋白、M蛋白、Gtrimer蛋白和M蛋白的抗原组合设计了mRNA疫苗，发现这五种疫苗候选物均能够诱导小鼠产生高水平的中和抗体，显示出很好的免疫原性。此外，刘隽等将RVCTN-1毒株的G蛋白的mRNA序列进行优化合成和纯化，之后将纯化后的mRNA序列与适宜载体进行组装和包装，形成mRNA疫苗颗粒，得到最终的mRNA疫苗制剂对小鼠通过静脉注射、皮下注射或肌肉注射等方式进行给药，能够诱导小鼠产生RVG蛋白特异性的免疫反应。MargitSchnee使用mRNA技术开发了一种编码RVG蛋白的mRNA,并将其注射到小鼠和家猪体内。结果显示，这种mRNA能够诱导小鼠和家猪产生高水平的中和抗体，保护小鼠和家猪不被RV感染。StitzL等根据RVG蛋白设计的mRNA疫苗可有效保护小鼠感染RV,进行人体Ⅰ期临床试验结果显示，71%测试者皮下注射80或160μg疫苗，46%测试者无针注射装置肌肉注射200或400μg疫苗，可诱导产生有充足保护效力的中和抗体。这些研究数据显示，基于不同蛋白设计的狂犬mRNA候选物均能使实验动物产生高水平的中和抗体，部分免疫攻毒实验数据显示，候选物对免疫动物提供了有效保护，使狂犬有望成为继新冠后的下一个研制成功的mRNA疫苗。

3.2 在口蹄疫研究中的应用

口蹄疫(Foot-and-mouth-disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth-diseasevirus,FMDV)引起的偶蹄兽的一种急性、热性、高度接触性传染病，猪、牛、羊最易感，人也偶尔感染发病，是世界上现有家畜传染病中最复杂、最受重视的疾病之一，传播速度极快，往往会造成大范围流行，传染性极强。

PulidoMR等将O血清型FMDV的基因组转录产生的mRNA注入小鼠体内。小鼠分为四组，其中一组为对照组注射生理盐水，另外三组分别注入10μg、50μg以及100μg体外转录的mRNA,其中接种mRNA的小鼠中，58%的小鼠都产生了高滴度的FMDV中和抗体，随后对这些小鼠进行攻毒实验，发现免疫的小鼠中，有38%的小鼠得到了有效的保护。该结果表明，使用FMDV基因组转录产生的mRNA可以在小鼠体内产生高水平的抗体[37],但如何产生足够有效的免疫保护还需进一步探讨。

3.3 在猪繁殖与呼吸综合征研究中的应用

猪繁殖与呼吸综合征病(Porcinereproductiveandrespira⁃torysyndrome,PRRS)是由猪繁殖和呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起猪的一种接触性传染病，主要导致仔猪呼吸道疾病和母猪繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。贺笋等利用PRRSV含有中和抗原表位的结构蛋白GP3、GP4、GP5、M和N蛋白，通过不同组合方式，将挑选的含有抗原表位的基因通过linker连接起来，进行后期融合表达。这5种蛋白根据不同的排列组合构建了三种mRNA疫苗，将这三种疫苗免疫小鼠，发现这些疫苗均能够模拟天然感染的过程，在机体细胞内被翻译、修饰，可以被MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子呈递，激活机体产生特异性的CD8+和CD4+T细胞，从而产生高水平的细胞免疫和体液免疫应答。

3.4 在流感研究中的应用

流感(Influenza)是由流感病毒(Influenzavirus)引起的人兽共患传染病，通常只感染禽类，但个别亚型也会感染猪或人。本病广泛分布于世界各地，甲型和乙型流感病毒呈季节性流行，每年有近300万~500万例病例，造成全世界29万~65万人死亡。禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)属于甲型流感病毒，根据病毒表面蛋白囊膜的血凝素(HA,)及神经氨酸酶(NA)的抗原性不同分为18种血凝素亚型和11种神经氨酸酶亚型。目前针对不同亚型的AIV疫苗具有良好的免疫保护效果，但由于AIV频繁的基因突变和重组，需要及时更新疫苗以应对疫苗与流行株之间存在的抗原差异。目前，广泛使用的AIV灭活疫苗和减毒活疫苗等传统疫苗生产周期长，无法及时研发出候选疫苗应对AIV的频繁变异，而mRNA疫苗由于生产周期较短，工艺与传统疫苗相比也更简单，有望成为未来代替传统疫苗的新型AIV候选疫苗。一项早期研究表明，用编码HA抗原的自扩增性mRNA(self‐amplifyingmRNA,SAM)疫苗进行免疫，可使小鼠产生特异性抗体和部分保护力，免受致病的同源病毒攻击。另一项研究针对H9N2亚型AIV设计出mRNA疫苗候选物，并对其安全性和免疫效力进行了评估，发现候选物对鸡安全，并可使SPF鸡产生高水平的体液免疫以及细胞免疫。与AIV全病毒灭活疫苗比较，对SPF雏鸡免疫25μgmRNA疫苗的抗体与全病毒灭活疫苗水平相当，之后对两种疫苗免疫的SPF雏鸡进行攻毒实验，荧光定量PCR检测咽拭子以及肺脏、气管、十二指肠和腺胃发现，25μg免疫剂量免疫的mRNA疫苗组与全病毒灭活疫苗组，除气管之外各个组织的病毒载量极显着低于未免疫的对照组(P<0.01),气管中全病毒灭活疫苗组显着低于对照组(P<0.05),25μg免疫的mRNA疫苗组极显着低于对照组(P<0.01)。这项结果表明mRNA疫苗在免疫保护上与灭活疫苗水平相当，但是mRNA疫苗生产周期比灭活疫苗的生产周期要短很多，这也大大彰显了mRNA疫苗的独特优势。ChahalJS等构建了包括H1N1HA抗原、刚地弓形虫抗原和埃博拉病毒多种抗原表达的mRNA疫苗，可以对H1N1AIV、刚地弓形虫和埃博拉病毒等多种致病性病原体免疫保护，产生特异性CD8+T细胞和抗体反应，攻毒试验结果表明，免疫一次即可使小鼠得到对H1N1AIV的有效保护。Vogel等用表达几种不同血清型的HA抗原的SAM疫苗对小鼠进行免疫，能够有效预防H1N1流感病毒。Arevalo等开发了一种编码了所有已知的20种甲型和乙型流感病毒亚型的HA抗原的mRNA(20-HAmRNA-LNP)疫苗，研究证明该疫苗可以同时诱导小鼠和雪貂产生对多种抗原的免疫反应。

3.5 在猴痘研究中的应用

猴痘(Monkeypox,Mpox)是一种由猴痘病毒(Monkeypoxvirus,MPXV)感染所致的病毒性人畜共患病，人类中出现的症状与过去在天花患者身上所看到的症状相似，但是自1980年世界上消灭天花以后，MPX成为现存最为严重的且由正痘病毒引起的疾病。Yang等构建了3种表达MPXA35R蛋白和M1R蛋白的mRNA疫苗，其中VGPox1和VGPox2是编码由A35R的胞外结构域和全长的M1R组成的融合蛋白，两者的区别在于VGPox2去除了A35R的茎区。而VGPox3含有两个单独的mRNA-LNP的混合物，分别编码A35R和M1R。免疫小鼠结果显示VGPox1和VGPox2比VGPox3具有更好的抗病毒能力。

3.6 在弓形虫病研究中的应用

弓形虫是一种单细胞寄生虫，其学名为Toxoplasmagondii,是一种广泛分布于世界各地的寄生虫。弓形虫能够感染人类和其他哺乳动物。弓形虫感染每年会导致超过100万人死亡。ChahalJS等人在他们的研究中利用树突状纳米粒子封装mRNA复制体，开发了一种六价mRNA疫苗。该疫苗的抗原是弓形虫的多个生命周期阶段中高度保守的蛋白质，包括GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A和AMA1。他们对小鼠进行了接种，每个小鼠接种单剂40μg的疫苗（每个复制子6.67μg),结果发现该疫苗可以保护小鼠在致命剂量的弓形虫感染中存活超过6个月。这项研究表明，利用树突状纳米粒子封装mRNA复制体制备的六价mRNA疫苗具有很高的保护效力，可以为弓形虫感染提供新的预防和控制手段。LuoF等构建了表达弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NT-Pase-Ⅱ)蛋白的LNPs-saRNA疫苗，该疫苗可诱导小鼠产生中和抗体；攻毒保护试验显示，免疫小鼠存活时间延长且脑内弓形虫量减少至对照组的46.4%。

3.7在细菌性疾病研究中的应用

mRNA技术在病毒上有较多的研究，只有极少数细菌抗原被尝试用于mRNA疫苗的构建。2017年，MaruggiG等人设计了两种预防性SAM疫苗，分别与编码A组链球菌溶血素-O(SLOdm)和B组链球菌(GBS)链球菌的毛发2a骨架蛋白(BP-2a)混合，接种小鼠进行动物试验，结果小鼠成功产生大量全功能抗体。在单一病原菌致病种中，细菌病原菌结核分枝杆菌致死率长期居全球首位。尽管如此，只有一种疫苗获准针对人类结核：卡介苗(BCG),这是一种减毒全细胞疫苗，但临床上存在局限性，一是卡介苗免疫效力在不同个体中差异较大中，免疫力较弱的人群即使免疫了卡介苗依然可能感染结核；二是BCG由许多遗传上不同的亚菌株组成。这些遗传差异是否以及如何影响BCG的效力仍然未知。MVA85A是一种表达单抗原Ag85A的结核亚单位疫苗，在IIb期试验中没有显着改善保护作用。失败案例说明与病毒感染相比，细菌感染往往具有更复杂的阶段，具有多种分子表达特征，仅表达单个抗原无法满足免疫保护要求。未来mRNA疫苗想进一步应用于细菌感染的预防和治疗领域，应考虑更多的优化，包括各种抗原或表位的选择和重组，不同靶抗原的周期性给药，甚至直接添加佐剂等被动免疫组合物。

在过去的十年里，mRNA技术已经从实验室走向临床应用，取得了良好效果。这种生物技术领域的突破性进展在冠状病毒病(COVID-19)全球大流行期间表现得尤为明显，也标志着mRNA技术正在逐步走向成熟。到目前为止，许多实验证明了mRNA疫苗无论从mRNA本身的特性，还有引发的免疫反应情况等方面来看，都优于亚单位疫苗、灭活疫苗等传统疫苗。

虽然mRNA技术发展迅速，但是它也存在一些问题和挑战，主要表现在以下几个方面。一是mRNA技术用于设计疫苗，首先需找到对该疫病可产生免疫保护力的关键蛋白以及最适UTR和质粒载体，而不像灭活病毒疫苗那样直接全病毒灭活，如何寻找最适蛋白及UTR和载体是至关重要的问题。此外，在设计mRNA序列时需要考虑到对细胞的毒性和免疫反应等因素,这也增加了技术的复杂性。二是mRNA分子的稳定性较差，容易被降解，导致注射进体内没有效果，所以如何保存mRNA疫苗不被降解也是一个难题。三是目前mRNA制备所涉及的几项关键原材料，由于受专利保护、技术壁垒、制备流程等因素限制，成本较高，若构建动物疫病mRNA疫苗，如何降低成本，也是需要解决的难点问题。

针对这些问题，要在病原端及基于LNP的mRNA疫苗冻干工艺端加快步伐。首先需要充分了解某种病原，收集病原UTR等序列库以供筛选，并建立自有的质粒载体，满足线性化酶切这一特殊需求；同时，也应该建立平台性的mRNA设计和筛选流程、以及平台性的工艺路线，即可适用于几乎所有的mRNA序列。研究表明基于LNP的mRNA疫苗冻干化处理后可以在室温下长期储存,这为mRNA疫苗的储存和运输提供了一个潜在的解决方案。同时，对于目前尚存在的专利保护及技术壁垒等问题，希望能够随着全球合作的进一步深化以及mRNA技术的进一步成熟来解决。

总体来说，mRNA技术是一项具有广阔前景的生物技术，它可以为许多疾病的治疗提供新的思路和方法，比如肿瘤疾病，遗传学疾病及各种自身免疫疾病，相信mRNA技术会成为这些疫苗开发的新突破；同时也会推动更多的动物mRNA疫苗的研发和应用，比如一些重要的动物传染病，如非洲猪瘟、猪圆环病毒病、犬猫细小病毒病等，可以根据这些病毒的靶抗原或者多种组合抗原的形式设计mRNA候选疫苗，随着mRNA技术的进一步发展以及对这些疾病的进一步探索，开发这些疾病的mRNA候选疫苗是非常有前途的策略。