新技术推介 | 病原富集的纳米孔宏基因组测序在兽医临床检测中的应用

病原富集的纳米孔宏基因组测序在兽医临床检测中的应用

建立的病原富集的纳米孔宏基因组测序方法，设备投入小，可在小型实验室部署。样品前处理、病原富集、建库、测序、分析全部流程可在24-48h内完成。该方法已在猫及猪病的临床诊断中初步应用，可对眼鼻咽拭子、血液、组织、粪便样品进行检测，对于疑难病例的诊断具有独特的优势。

本方法对临床样品（拭子、血样、组织样品等）进行RNA和DNA的提取、RNA的反转录、DNA扩增、测序引物的连接、测序，在此过程中的多个步骤进行改进，以达到对病原微生物的核酸进行富集的目的，并使用第三代纳米孔测序技术进行宏基因组测序，结合云端及本地分析软件进行分析，发现样品中存在哪些病原微生物，组装出部分或完整的病原序列。

1. 使用第三代纳米孔测序技术进行宏基因组测序，克服了传统二代测序技术设备投入高，检测周期长的缺点。该方法设备要求低，可在小型实验室、动物医院进行部署。

2. 传统宏基因组测序宿主基因占绝大部分，病原基因只占0.1%-5%，该方法通过对核酸提取、扩增、测序等多个步骤进行改进，富集病原微生物的基因（提高3-20倍），从而提高病原检测的敏感性，降低测序的成本。

通过测序方法及数据分析方法改进，使整个检测用时缩短，从临床样品开始处理到数据分析完成，可在24-48h内完成并给出检测报告（送测序公司通常需要2周），使宏基因组测序具有临床应用的价值。

（一）猪场临床案例

案例1：盖塔病毒（Getah virus）导致的仔猪死亡

临床症状：产房仔猪出现神经症状，大量死亡。类似伪狂犬，但症状轻，常规病原检测阴性。

样品类型：肺组织及脑组织

检测结果：宏基因组测序分析发现仔猪样品中有大量的盖塔病毒。结合临床症状及病理切片（病毒性脑病），最终确定该猪场大量仔猪死亡的主要病因为盖塔病毒感染。

通过组装得到了几乎完整的盖塔病毒序列（完整度95%，11027bp/11597bp），并进行了进化分析，发现与该地区蚊子上发现的盖塔病毒同源性最高，可能是蚊子导致的传播。

案例2：札幌病毒引起的产房仔猪腹泻

临床症状：某猪场产房仔猪发生腹泻，发病率高，死亡率低，有一定自限性。

样品类型：肠道组织

常规检测结果：细菌培养未见致病病原。病理切片检查发现一头仔猪空肠有疑似病毒引起的损伤，肠绒毛受损，空泡化，但常规病毒PCR检测阴性。

宏基因检测结果：肠道组织内有大量的猪肠道札幌病毒（Porcine enteric sapovirus)和猪柯布病毒(Porcine kobuvirus)，得到大量两种病毒序列，并最终组装得到几乎完整的病毒序列。结合病理切片中肠绒毛损伤情况，最终判定产房仔猪腹泻是由札幌病毒单独或与柯布病毒一起导致的。

案例4：诺维氏梭菌引起母猪死亡的非典型案例

临床症状：某猪场母猪群发生呼吸道症状并出现母猪死亡

样品类型：肺脏及肝脏组织

宏基因组测序结果：除有多杀巴氏杆菌外，发现有诺维氏梭菌的存在。诺维氏梭菌是引起母猪死亡的常见原因，但该病例中未见典型的肝脏损伤（泡沫肝）。

经过对病理切片的仔细观察，发现在母猪心肌中有大量的梭菌存在，证实诺维氏梭菌感染的存在，应为母猪死亡的直接原因，而多杀巴氏杆菌是母猪呼吸道症状的主要原因。

案例5：纳米孔宏基因组测序在猪场健康监测中的应用

背景：本案例为猪场呼吸道疾病的健康监测，挑选有呼吸道症状的产房仔猪及保育猪，取肺组织进行宏基因组测序。

宏基因组测序结果：

经过序列分析、组装，发现猪群中存在圆环病毒2型（PCV2d毒株）、猪细小病毒、PRRSV（NADC30毒株）、肺炎克雷伯菌、多杀巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、鼻支原体及猪链球菌。

病原富集的纳米孔测序可应用于猪场疾病的健康监测，从不同群体中发现该场存在的所有致病病原，以采取相应的预防、治疗措施。

对中国农业大学动物医院临床就诊的宠物猫进行采样，已检测10多例各种类型疾病的宠物猫。

样品类型包括：眼鼻咽拭子、血液、腹水

宏基因组测序后发现的常规病原：猫冠状病毒、疱疹病毒、杯状病毒、细小病毒、白血病病毒、免疫缺陷病病毒、猫支原体、衣原体。

发现的非常见病原：猫乳头瘤病毒、猫麻疹病毒，及一种变异的逆转录病毒。