集宠学苑 | 一款含侧柏籽萃取物的营养保健品对IL-1诱导的软骨外植体炎症反应的影响

一款含侧柏籽萃取物的营养保健品对IL-1诱导的软骨外植体炎症反应的影响

Wendy Pearson, PhD; Michael W. Orth, PhD; Niel A. Karrow, PhD; Michael I. Lindinger, PhD

* a: DN-Sashas 4C是一款由绿唇贻贝、鲍鱼虹膜、鲨鱼软骨和侧柏籽组成的专利配方营养保健品。

* b:侧柏籽萃取物(Biota orientalis)专属于澳大利亚Interpath公司

* 加拿大圭尔夫大学安大略兽医学院生物医学系、安大略农业学院动物与家禽科学系、生物科学学院人类健康与营养科学系

* 发表于《American journal of veterinary research》AJVR, Vol 69, No.12, December 2008

* 文献整理翻译：北京集宠国际贸易有限公司-技术部

[摘要]

本试验目的是为了验证一款含侧柏籽萃取物(Biota orientalis)b的营养保健品(DN-Sashas 4Ca，由绿唇贻贝、鲍鱼虹膜、鲨鱼软骨和侧柏籽组成)的模拟消化液能够抑制白细胞介素(IL)-1刺激下体外软骨中前列腺素E2 (PGE2)、一氧化氮(NO)和粘多糖(GAG)的产生。分别使用浓度为0.06或0.18mg/mL的侧柏模拟消化液(BOsim)或Sashas 4C(DNsim)模拟消化液、0或0.02mg/mL吲哚美辛模拟消化液(INDOsim)和空白消化液(BLsim)，体外培养关节软骨72h。在培养的最后48h，使用0或10ng/mL的人IL-1β刺激关节软骨。试验结束后测定样品中PGE2、GAG和NO的浓度，并对软骨组织进行荧光染色以测定软骨细胞活力。结果发现：1)在IL-1刺激下，空白对照组中PGE2、GAG和NO的浓度增加。无论有无IL-1刺激，吲哚美辛均可减少PGE2浓度，但增加了NO浓度以及未受到IL-1刺激的关节软骨中GAG浓度；2) Sashas 4C (0.06和0.18 mg/mL)降低了IL -1刺激和未刺激下软骨中PGE2的浓度，降低了IL-1刺激下软骨中NO的浓度，增加了未刺激软骨中NO的浓度；3)在IL-1刺激下，Sashas 4C (0.18mg/mL)和侧柏(0.18mg/mL)能提高软骨细胞活力，侧柏(0.06和0.18 mg/mL)可降低PGE2浓度。

马、狗和人的关节健康需要提前预防。其中一种产品由新西兰绿唇贻贝、鲨鱼软骨、鲍鱼和侧柏籽油萃取液组成,即DN-Sashas 4C，最近一项研究已证实，在IL-1刺激的关节软骨炎症模型中，鲍鱼、鲨鱼软骨和绿唇贻贝的消化物可参与抑制PGE2(鲨鱼软骨和新西兰绿唇贻贝)、GAG(鲍鱼和新西兰绿唇贻贝)和NO(鲍鱼)的释放，提高活/死细胞的比值(鲨鱼软骨和新西兰绿唇贻贝)。侧柏是一种原产于中国西部和朝鲜的草本植物，作为50种基本草药之一，在中医中具有很高的价值。体外研究发现，侧柏籽油可减少肝脏中磷脂酰胆碱释放花生四烯酸，故侧柏籽油的开发用途是减少PGE2的产生。本研究的目的是验证一款含侧柏籽萃取物(Biota orientalis)的营养保健品(DN-Sashas 4C) 能抑制IL-1刺激下关节软骨中PGE2、GAG、NO的产生，且不影响细胞活力这一假设。此外，还假设Sashas 4C的抑制效果将优于任何单一成分在相同浓度下的抑制效果。

模拟消化：将Sashas4C-DNsim（含新西兰绿唇贻贝、鲍鱼虹膜、鲨鱼软骨和侧柏籽等）、纯侧柏b-BOsim和吲哚美辛分别置于模拟胃液和肠液中进行消化处理，随后离心、过滤、分馏。同样的方法制备空白模拟消化液。

软骨培养：首先，所有软骨在Dulbecco's 改良培养基中稳定培养24h；随后，向990μL的新鲜培养基中分别加入10 μL空白模拟消化液（简称对照组）、Sashas4C模拟消化液(0.06 或 0.18 mg/mL（简称Sashas 4C组）、侧柏模拟消化液(0.06 或 0.18 mg/mL) （简称侧柏组）或吲哚美辛模拟消化液(0.02 mg/mL) （简称吲哚美辛组）培养72h；最后，将重组人IL-1β(0[无刺激]或10ng/mL)分别添加到上述4种条件培养基中，继续培养48h。

样品收集和分析：培养72h后收集全部条件培养基，用于评估IL-1刺激前PGE2、GAG或NO浓度，收集的样品立即在-80°C冷冻直至分析；收集IL-1(0或10 ng/mL)刺激24h和48h的培养基样品；实验结束后，将软骨组织收集到装有无菌PBS溶液的无菌微离心管中，染色测定细胞活力。

PGE2浓度：与未刺激的软骨相比，IL-1刺激体外软骨24h(419.4 ± 68.1 pg/mL vs 844.2 ± 102.9 pg/mL；图1)和48h后(363.0 ± 43.5 pg/mL vs 600.4 ± 36.8 pg/mL；图1)可显著提高对照组中PGE2浓度。吲哚美辛可显著抑制任何时间点受刺激和未受刺激的软骨组织释放PGE2。任何时间点，0.06或0.18mg/mL的Sashas4C都能显著抑制IL-1刺激下软骨释放PGE2，且浓度低于未刺激的关节软骨组。在 IL-1 刺激前以及刺激后24h和48h，Sashas4C对PGE2释放的抑制作用与吲哚美辛相当。

图1. 软骨组织培养基样品中PGE2的浓度

*BOsim和DNsim(0.06 mg/mL [A和B]或0.18 mg/mL [C和D])、吲哚美辛(0.02 mg/mL).软骨分别用IL-1 (10 ng/mL [A和C])刺激或未刺激(B和D)，不同上标字母表示不同时间点之间的数值差异显著(P < 0.05)

GAG 浓度：与未受刺激的对照组软骨相比，IL-1(10 ng/mL)刺激24h(75.5 ± 6.5 μg/mL vs 169.9 ± 18.6 μg/mL)和48h(55.65 ± 2.9 μg/mL vs 120.1 ± 9.8 μg/mL；图2)显著增加了GAG浓度。与刺激前相比，0.06mg/mL Sashas 4C（DNsim）调节IL-1刺激下软骨GAG浓度显著增加。

IL-1刺激24h (175.7±15.5 mg/mL)和48h (133.1±18.1 mg/mL)，用吲哚美辛调节未刺激软骨的GAG浓度显著高于未刺激对照组软骨。

图2. 软骨组织培养基样品中GAG的浓度

*BOsim和DNsim(0.06 mg/mL [A和B]或0.18 mg/mL [C和D])、吲哚美辛(0.02 mg/mL).软骨分别用IL-1 (10 ng/mL [A和C])刺激或未刺激(B和D)，不同上标字母表示不同时间点之间的数值差异显著(P < 0.05)

NO 浓度：与未刺激对照组软骨相比，IL-1(10 ng/mL)刺激24 h(0.28 ± 0.04 μg/mL vs 1.26 ± 0.13 μg/mL；图3)和48h(0.19 ± 0.04 μg/mL vs 1.04 ± 0.08 μg/mL；图3)后，对照组NO 浓度显著增加。与对照组软骨相比，无论有无IL-1刺激，吲哚美辛(INDOsim)可使对软骨NO浓度显著增加。与IL-1刺激的对照组软骨相比，Sashas 4C(DNsim)显著降低刺激24h(0.06和0.18μg/mL分别为 0.91 ± 0.11 μg/mL和0.92 ± 0.10 μg/mL)和48h(0.06和0.18μg/mL分别为 0.61 ± 0.10μg/mL和0.58 ± 0.09μg/mL) NO浓度。

图3. 软骨组织培养基样品中NO的浓度

*BOsim和DNsim(0.06 mg/mL [A和B]或0.18 mg/mL [C和D])、吲哚美辛(0.02 mg/mL).软骨分别用IL-1 (10 ng/mL [A和C])刺激或未刺激(B和D)，不同上标字母表示不同时间点之间的数值差异显著(P < 0.05)

细胞活力：在 0.18 mg/mL的浓度下，Sashas 4C(DNsim)能显著提高 IL-1 刺激下软骨的细胞活力。

图4. 软骨外植体中C-AM与EthD-1荧光的比值

*软骨分别用BLsim、INDOsim、DNsim或BOsim培养48小时，然后用IL-1 (10 [A]或0[无刺激;B] ng/mL)用于最后48小时的培养。实验结束时收集外植体，立即用C-AM和EthD-1染色，测定细胞活力。*值与对照BLsim值差异显著(P < 0.05)。

研究的结果支持最初的假设，即含侧柏籽萃取物(Biota orientalis)的营养保健品DNsim-Sashas 4C可减轻IL-1对关节软骨的不良刺激，且对软骨细胞存活和代谢无负面影响。吲哚美辛作为抗炎药，虽能抑制IL-1刺激下PGE2的产生，但对软骨代谢有明显的不良反应。本研究发现与吲哚美辛相关的NO浓度增加；其他研究发现，与吲哚美辛相关的蛋白聚糖合成受抑制。这些都表明它是一种不适合治疗关节炎症的药物。

本试验证明DNsim-Sashas 4c能部分抑制IL-1刺激下PGE2的产生。由于本试验使用的模拟胃液和肠液难以彻底乳化DNsim，这可能导致DNsim对PGE2的抑制效果被低估。与相同剂量下单个成分的效果相比，Sashas 4C抑制NO和PGE2的效果显著提高。这种组合效应可能是由于不同成分影响了PGE2或NO不同的合成途径。推测DNsim中的活性物质是GAG、ω-3脂肪酸和蛋白质。研究发现，GAG具有抗炎作用，其可特异性的抑制COX-2。这种作用可能导致本试验发现的协同抑制NO和PGE2的产生。

在经DNsim-Sashas 4C介入处理的软骨中，IL-1诱导的NO释放显著减少。这可能是由于Sashas 4C通过与 IL-1 无关的途径发挥作用的结果；然而，这也可能是基于分别催化PGE2和NO形成的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶(COX)的关联调节来实现的。iNOS和COX-2的净表达部分依赖于细胞外NO和PGE2的相对数量。因此，增加细胞外NO含量可以有效抑制COX-2的表达。这也解释了为什么Sashas 4C对IL-1刺激下的软骨中NO释放有显著的抑制作用。

本研究发现，DNsim-Sashas 4C可显著增加IL-1刺激下软骨细胞的活力。这种活力的增加并不是通过抑制细胞凋亡来实现的。本试验发现， DNsim-Sashas 4C调节下的软骨细胞活力大于未刺激的对照组软骨。软骨细胞生长的主要机制归因于PGE2与其4种细胞表面受体中的1种(即EP1-4)的结合，特别是EP1或EP2。DNsim-Sashas 4C或许通过提供侧柏提取物来对参与软骨细胞增殖的前列腺素类受体产生激动剂作用，导致活细胞染色增加。充当PGE2受体激动剂的物质产生类似于增加细胞周围环境中PGE2量的作用。IL -1刺激的细胞产生的PGE2通过负反馈机制被细胞外PGE2浓度的增加所抑制。这同时也为DNsim-Sashas 4C抑制PGE2释放提供依据。

受篇幅限制，原文略有删减