153-2012-0258
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2018年8月,在辽宁沈阳出现了中国首例非洲猪瘟(African swine fever,ASF)，随后该病迅速蔓延到各省市。因为该病没有安全有效的疫苗也没有有效的药物，防控该病主要通过早发现、早处置，减少疫病的蔓延和扩散。能够敏感的检测非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测技术快速普及，大量的荧光PCR检测仪器和试剂快速推向市场，在帮助我国控制非洲猪瘟传播，阻断该病进入猪场的过程中起到了重要的作用。我们对市场上的一些荧光PCR仪器进行了抽样检测，发现不同厂家的荧光PCR仪器检测性能存在较大差异。
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材料与方法
1) 样本
实验所检测的样本为现地获取的随机样本。
2) 检测试剂盒与检测方法
验证实验采用瑞普(保定)生物药业有限公司生产的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒进行检测。试剂盒操作方法见说明书，分别采用核酸释放剂对样本进行快速裂解处理和DNA/RNA共提取试剂盒提取检测两种方法。
DNA/RNA共提取试剂盒采用湖南冠牧生物科技有限公司产品。
比对涉及设备
3）仪器操作
选择FAM通道检测ASFV-DNA，选择HEX或VIC通道检测参照。
反应程序设置如表一
仪器使用参照仪器说明书进行。
4) 统计学处理
采用Excel2007，通过计算变异系数（CV）比较不同实验的批内重复性。
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结果
使用免提取直接裂解法检测，分别在SLAN24P和A型号荧光PCR上检测，开启双通道模式，A型号检测Ct值与SLAN24P相比 ，FAM通道拖后3.7～11.7Ct，平均拖后5.8Ct，Hex通道拖后5.6～18.1 Ct，甚至HEX无法检出值。检测敏感性降低10倍到数千倍。
使用免提取检测，SLAN24P内标CV为5.9%，免提取检测唾液样本，存在一定干扰，检测CV有一定偏差，但是在合理范围。A生物A型号型号CV为97.8%，完全无法指示反应。
为了分析A型号性能明显异常原因，进一步对样本提取核酸后，使用单通道模式，只开启FAM通道进行检测。在单通道模式下，A型号检测Ct值与SLAN24P相比 ，平均拖后1.3Ct。
需要注意的是核酸提取在8月13日完成，A型号仪器扩增在8月13日进行，SLAN24P仪器扩增在8月14日进行。提取核酸放置过夜，Ct值大约拖后1～2 Ct。
B公司B荧光PCR仪与SLAN24P比对结果
使用免提取直接裂解法检测，分别在SLAN24P和B型号荧光PCR上检测， B型号检测Ct值与SLAN24P相比 ，FAM通道平均拖后2.9Ct。检测敏感性降低接近10倍。
C公司C型号荧光PCR仪与SLAN24P比对结果
对SLAN24P和C型号荧光PCR仪开展了一系列实验进行检测。使用免提取方法检测溶血样本SLAN24P检测内标正常，C型号内标无法显示，该设备对样本纯净性要求比较高，杂质含量高时可能影响检测结果。两份阴性样本，提取核酸检测SLAN24P和C型号荧光PCR仪检测结果一致。3份不同浓度样本，提取核酸检测SLAN24P全部检出，C型号荧光PCR仪一份样本未检出。
选取一份阳性样本提取核酸后104、105、106、107倍梯度，每个梯度设置3个重复，分别用SLAN 24P和C型号荧光PCR仪上机检测。SLAN 24P和C型号荧光PCR仪检测Ct值无明显差异，检测内标CV分别为2.5%和1.8%，仪器孔间稳定性良好。SLAN 24P仪器104、105、106倍梯度均可检出，107倍梯度稀释三个重复均未检出；C型号荧光PCR仪104、105梯度稀释均可检出，106倍梯度稀释二个重复检出一个未检出，107倍梯度稀释三个重复均未检出。此次比对实验总共19份样本， SLAN 24P检出12份阳性，C型号荧光PCR仪检出10份阳性，SLAN 24P检测敏感性略高。
上海宏石医疗科技有限公司SLAN24P与Roche Diagnostics Corp LC480、ABI公司7500、Q3、Q5型荧光PCR仪比对结果
随机抽取一份血浆阳性样本10、102、103稀释，使用免提取检测，分别使用SLAN24P、ABI7500、ABI Q3、ABI Q5和Roche Diagnostics Corp LC480五款荧光PCR仪进行检测，三个厂家五个型号产品，检测Ct值没有明显差异，内标CV分别为0.3、0.5、1.8、0.2、0.5，仪器孔间差异小。
随机抽取一份血浆阳性样本提取核酸后10、102、103、104、105、106、107倍稀释，分别使用SLAN24P、ABI7500、ABI Q3、ABI Q5和Roche Diagnostics Corp LC480五款荧光PCR仪进行检测，三个厂家五个型号产品，检测Ct值没有明显差异，内标CV分别为0.2、0.2、0.7、1.4、0.9，仪器孔间差异小。五款仪器10、102、103、104、105倍稀释均可检出，106稀释ABI7500未检出，107稀释均未检出，五款仪器总体敏感性无显著差异。
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结论
上海宏石医疗科技有限公司 SLAN24P荧光PCR仪与进口品牌ABI7500、ABI Q3、ABI Q5和Roche Diagnostics Corp LC480荧光PCR仪定量Ct值、检测敏感性无明显差异，孔间差异小。
A公司A型号荧光PCR仪标称四通道设备，实际上第二通道都无法使用，只能使用单通道。在单通道模式下检测Ct值相对SLAN24P荧光PCR仪拖后1.3以上。
B公司B型号荧光PCR仪检测Ct值相对SLAN24P荧光PCR仪平均拖后2.9Ct。检测敏感性低接近10倍。
C公司C型号荧光PCR仪定量Ct值与SLAN24P荧光PCR仪无明显差异，孔间差异小。弱阳性样本检测和梯度稀释实验检测敏感性略逊于SLAN24P荧光PCR仪。在复杂样本方面，C公司仪器表现性相对SLAN24P荧光PCR仪较差。
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讨论
非洲猪瘟防控过程中，生物安全防控和精准清除是目前实用最广泛的防控手段，猪场通过采集环境拭子、唾液、鼻咽拭子等对非洲猪瘟病毒进行早发现，这些样本中病毒含量通常都非常低，检测敏感性差的设备可能导致大量阳性样本漏检，检测失去意义。在非洲猪瘟防控过程中，荧光PCR仪选择首要考虑仪器敏感性。目前有大量敏感性欠缺的设备充斥市场，可能导致生物安全防控和精准清除失败。
要保证检测结果准确可靠，荧光PCR试剂需要有内参照，以监控每个反应孔是否成立。真实、稳定的双通道设备应该是荧光PCR仪最基础的配置。随着疫苗的推出，检测过程中需要对野毒和疫苗毒鉴别；在对疫病进行快速鉴别时，涉及到三种疫病进行鉴别诊断，有条件的养殖场最好配备四通道检测设备。目前也有很多标称二通道或者四通道的荧光PCR第二通道或者三、四通道无法使用，需要对设备进行验证实验。
荧光PCR检测除了定量检测Ct值具有重要的定量意义，例如圆环病毒病检测不同的Ct值，可能对实际生产具有完全不同的指示意义。在非洲猪瘟检测过程中，不同的Ct值，也需要采取不同等级的生物安全措施。荧光PCR仪保证Ct值准确、稳定、可靠也非常重要。（完）
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