科研进展 | 纳米颗粒疫苗触发IFN-γ的产生并赋予对PRRSV的保护性免疫

来源：动保视界

篇名：纳米颗粒疫苗触发IFN-γ的产生并赋予对PRRSV的保护性免疫
作者：孙杨杨¹,²，高雁怩¹,²，苏潼键¹,²，张路捷¹,²，周昊然¹,²，张杰¹,²，孙海凤¹,²，白娟¹,²,³，姜平¹,²,³*

作者单位：1.农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室；2.教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室；3.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

南京农业大学动物医学院姜平教授团队于2025年1月发表在ACS NANO杂志上名为“Nanoparticle Vaccine Triggers Interferon Gamma Production and Confers Protective Immunity against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus”（纳米颗粒疫苗触发IFN-γ的产生并赋予对PRRSV的保护性免疫）的文章，在这项研究中，作者在PRRSV NADC30-like毒株的结构蛋白中鉴定了7个能够诱导IFN-γ产生的短肽。随后利用SpyCatcher-SpyTag系统设计了三种基于这些肽的重组抗原，并将其展示在铁蛋白纳米颗粒表面，形成了三种不同的自组装纳米颗粒，免疫后在小鼠和猪体内引发了强烈的PRRSV特异性细胞免疫反应。为防控PRRSV提供了一种有前景的候选疫苗，并证实了纳米颗粒蛋白作为下一代PRRSV疫苗开发平台的实用性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)每年给养猪业造成重大经济损失。由于现有的商业疫苗对流行性PRRSV的保护作用有限，因此迫切需要创新的解决方案。通常，在病毒感染后，体液和细胞免疫应答之间的协作对于病原体的抑制和清除是必不可少的。然而，细胞和体液免疫反应的作用因特定病毒而异。例如，体液免疫反应对于预防和消除猴痘病毒和猪圆环病毒引起的感染至关重要。相反，对于一些引起长期感染的病毒，如PRRSV，体液免疫反应的效力有限，而细胞免疫反应起主要作用。因此，设计能够有效诱导针对PRRSV的特异性细胞免疫应答的疫苗是下一代疫苗研究的首要目标。特异性细胞免疫应答依赖于相应的T细胞表位。因此，确定相关的T细胞表位并在此基础上设计重组蛋白是产生诱导特异性细胞免疫反应的疫苗的有效策略，这种方法最近已应用于SARS-CoV-2疫苗的开发。

纳米颗粒疫苗可诱导强大的免疫应答，已成为疫苗开发的一个有前景的方向。研究表明，基于铁蛋白的纳米颗粒可以引发针对多种病毒的保护性免疫。这种细菌蛋白是天然的、无毒的、耐热的，可以用简单、快速、廉价的方法制备，可以按比例进行大规模生产。SpyCatcher-SpyTag系统可以方便、高效地将蛋白抗原装载到纳米颗粒表面，从而可以直接、快速地生产重组纳米颗粒。

因此在这项研究中，作者设计并生产了一种自组装的铁蛋白纳米颗粒疫苗来对抗流行性PRRSV。动物实验表明，三种纳米颗粒的混合物在小鼠和猪体内强烈引发PRRSV特异性细胞免疫反应，为对抗流行性PRRSV提供了一个有希望的候选疫苗。也为开发动物疫苗提供了一个实用平台。

结果一：PRRSV结构蛋白T细胞表位的分析与鉴定

IFN-γ是调节细胞免疫应答的重要细胞因子，在多种病毒感染的体内控制和清除病原体中起着重要作用。为了鉴定PRRSV内潜在的T细胞表位，作者使用NetMHCpan 4.1和IEDB分析了52个猪白细胞抗原(SLA)- I等位基因对大流行PRRSV NADC30-like毒株结构蛋白的抗性(图1A)。分析得到4536个与SLA结合的短肽，长度为8到10个氨基酸。图1B总结了结构蛋白不同位置的预测得分，并显示了潜在表位的分布。将rank小于0.5的SLA - 1结合肽归类为候选表位，选择58个肽进行合成和实验评价。

用PRRSV FJ1402对11头猪进行攻毒，在4周内两次攻毒，并在攻毒后28天和42天分离PBMCs，使用ELISpot分析PRRSV特异性IFN-γ分泌(图1A)。由于PRRSV特异性IFN-γ分泌在接种后42天明显高于接种后28天(图1C)，因此在接种后42天收集PBMC进行短肽合成刺激，以测试T细胞对抗原表位的反应。在IFN-γ ELISpot筛选后，发现58个肽中的7个具有27.3%至72.7%的稳健应答率(表1)，并被进一步分析为与IFN-γ产生相关的潜在T细胞表位。

为了更好地了解不同猪的PBMC在相同肽刺激下的不同反应，作者克隆了11头实验猪的SLA-1基因并对其进行了测序。图1D的系统谱显示，SLA-1基因分为4个不同的类群。这一结果突出了猪种群中SLA基因的多态性，并可能解释为什么不同的猪PBMCs对相同肽的反应不同。因此，在设计重组抗原以在尽可能多的猪中诱导特异性细胞免疫应答时，需要考虑广泛的SLA基因型的覆盖范围。

 图1. PRRSV NADC30-like毒株结构蛋白中T细胞表位的分析与鉴定

表1肽刺激ELISpot法检测PBMCs中IFN-γ分泌

 结果二：重组蛋白的设计、纯化和表征

为了增强蛋白质的免疫原性，作者用SpyCatcher-SpyTag系统生产自组装纳米颗粒，首先将设计的重组抗原通过柔性连接体与SpyCatcher蛋白融合，并在c端添加His和Strep标签以进行纯化(图2A)。Alphafold预测的蛋白质结构表明，重组抗原和SpyCatcher标签之间的距离可能足以在纳米颗粒上进行表面展示(图2A)。随后作者利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达了GP3m-SpyCacher、GP4m-SpyCacher和GP5mSpyCacher三种重组蛋白(图2B)。

SpyTag- Ferritin蛋白使用大肠杆菌系统表达，用作纳米颗粒骨架蛋白(图2C)。蛋白质结构预测表明SpyTag位于铁蛋白纳米颗粒的表面，为与SpyCatcher的组装提供了结构基础(图2C)。ELISA结果表明，纯化的重组蛋白GP3m-SpyCacher、GP4mSpyCacher和GP5m-SpyCacher能与猪血清反应，而Spytag -铁蛋白则不能(图2D)。

图2.重组抗原的设计、纯化和鉴定

结果三：铁蛋白纳米颗粒的组装与表征

通过优化蛋白表达和纯化条件，制备纯化的重组蛋白并在体外组装(图3A)。蛋白- spycatcher和SpyTag-Ferritin在4℃孵育前按不同的摩尔比混合，通过SDS-PAGE检测蛋白的偶联效率（图3B）。然后使用SEC分析组装的蛋白质，以确认它们是否可以以可溶性纳米颗粒蛋白质形式存在。SEC分析显示，未组装的SpyTag-Ferritin在洗脱过程中早期显示单峰，表明该蛋白为聚合物形式(图3C)。与此相反，组装后的SpyTag-Ferritin和多余的Spycatcher-蛋白被洗脱为两个主峰(图3C)。洗脱的蛋白也用SDS-PAGE进行了表征(图3C)，并且用动态光散射(DLS)对SEC第一个峰洗脱的蛋白进行了进一步的分析 (图3D)。然后用电镜观察蛋白质共轭纳米颗粒的结构特征。如图3E所示，未组装的Spytag -铁蛋白纳米颗粒样品中有许多形状均匀的颗粒状物体，边缘相对光滑，而蛋白质共轭铁蛋白纳米颗粒表面粗糙，有小突起。结合SEC, DLS和TEM数据，作者证实了蛋白质-SpyCatcher成功组装Spytag -铁蛋白纳米颗粒表面。

此外，蛋白质-铁蛋白纳米颗粒表现出优异的稳定性，经过五次冻融循环后，蛋白质-铁蛋白纳米颗粒的稳定性仍未受到影响(图4A)。在不同储存条件下的测试显示，在4°C条件下1周或- 20°C条件下6个月后，其溶解度、Rd或PDI没有显著变化(图4B)。SDS-PAGE分析证实了没有降解带(图4C)。

图3.铁蛋白纳米颗粒的组装与表征

图4.三种铁蛋白纳米颗粒的稳定性试验

结果四：FeCocktail疫苗在小鼠体内引发强烈的体液和细胞免疫反应

作者分别用蛋白- Spycatcher (5μg)、蛋白- Spycatcher混合物(由GP3m-SpyCatcher、GP4m-SpyCatcher和GP5m-SpyCatcher按1:1:1的质量比混合而成，每种成分5 μg)、蛋白-铁蛋白(5 μg)、蛋白-铁蛋白混合物(将GP3m-Fe、GP4m-Fe和GP5m-Fe按1:1:1的质量比混合制成，更名为FeCocktail)免疫5只小鼠。3周后用相同剂量的免疫原加强免疫，加强3周后收集血清(图5A)。结果显示铁蛋白纳米颗粒比可溶性单体蛋白引发了更强的体液免疫反应，这可以通过更高水平的GP3m、GP4m和GP5m抗体来证明(图5B - D)。一致地，淋巴细胞增殖试验表明，与单体蛋白免疫相比，铁蛋白纳米颗粒免疫后淋巴细胞活化更有效(图5F)，证实了纳米颗粒蛋白有效激活小鼠免疫系统。

随后作者对FeCocktail的成分也进行了测试，以研究它们在诱导体液免疫反应时是否相互干扰。结果显示，针对FeCocktail和相应的蛋白-铁蛋白免疫组产生的抗体水平没有显著差异(图5B - D)，表明没有可检测到的交叉干扰。但是在两次FeCocktail疫苗免疫后，小鼠虽然观察到强烈的体液免疫反应，但在小鼠血清中无法检测到中和抗体(图5E)。

加强免疫三周后，分离小鼠脾脏的单细胞悬液，用Cocktail蛋白刺激。使用流式细胞术评估每种特定细胞类型的细胞因子分泌，研究结果表明，FeCocktail疫苗显著增加了分泌IL-4和IFN-γ的CD3+CD4+细胞的比例和数量(图5G−J)。CD3+CD4+细胞分泌IL-4和IFN-γ的同时升高表明FeCocktail疫苗免疫诱导了Th1和Th2的平衡免疫反应。由于PRRSV特异性细胞毒性T淋巴细胞对病毒清除至关重要，接下来作者分析了CD3+CD8+ T细胞的活化。与单体蛋白相比，FeCocktail显著增强了抗原特异性多功能CD8+ T细胞的活化，表现为CD8+ T细胞释放IFN-γ和IL-2的比例和数量显著增加(图5H−J)。此外，如图5K所示，与Cocktail单体蛋白疫苗相比，FeCocktail疫苗诱导CD8+中枢记忆T细胞和CD4+和CD8+效应记忆T细胞的数量显著增加。这些发现表明FeCocktail疫苗具有强大的免疫原性，可在小鼠体内有效诱导强大的体液和细胞免疫反应。 

图5.FeCocktail疫苗在小鼠体内引起强烈的体液和细胞免疫反应

结果五：FeCocktail疫苗在仔猪中诱导强烈的免疫应答

由于PRRSV对猪肺泡巨噬细胞表现出特异性的趋向性，并在感染猪体内诱导免疫抑制，因此作者在猪身上评估了FeCocktail疫苗的免疫原性。将25头未感染PRRSV、ASFV、CSFV和PCV2的健康仔猪分为5组进行免疫，3周后进行加强免疫(图6A)。两次免疫后。纳米颗粒疫苗在仔猪中诱导了有效的免疫应答，GP3和GP5特异性抗体水平显著增加，而抗Gp4蛋白抗体未检测到(图6B - D)。用GP3m-Fe和FeCocktail蛋白免疫后，淋巴细胞也出现增殖(图6G)。与小鼠实验结果一致，免疫仔猪血清中未检测到中和抗体(图6E)。

IFN-γ已被确定为猪PRRSV感染和清除的关键细胞因子。为了评估接种后IFN-γ的效果，作者在接种3周后收集免疫仔猪的PBMC，用纯化的PRRSV FJ1402体外刺激，检测特异性IFN-γ的产生。ELISpots分析显示，FeCocktail蛋白免疫仔猪可有效刺激PRRSV特异性IFN-γ的产生(图6F)。值得注意的是，IFN-γ的产生主要归因于GP3m-Fe和GP5m-Fe蛋白(图6F)。细胞内细胞因子染色证实了ELISpot的结果(图6H)。

图6. FeCocktail疫苗在仔猪中的免疫原性

结果六：FeCocktail疫苗可有效减轻感染仔猪的临床症状并加速病毒清除

根据加强免疫后检测到的体液和细胞免疫应答，选择FeCocktail蛋白免疫组进行攻毒，评估其对病毒感染的保护作用。结果显示，接种FeCocktail蛋白的仔猪在攻毒后3周内保持正常体温(<40°C)，而接种PBS的仔猪在攻毒后10天内出现持续发热(图7A)。此外，FeCocktail蛋白免疫组与对照组相比，临床症状明显减轻，主要是在食欲、精神状态和呼吸状况方面(图7B)。在试验期间，接种FeCocktail蛋白的仔猪的日增重与健康仔猪无显著差异，而PBS组的日增重因发烧和食欲下降等症状而降低(图7C)。总之，这些临床指标表明FeCocktail蛋白对仔猪PRRSV感染具有有效的保护作用。此外，FeCocktail蛋白免疫显著降低了感染后7天和14天血清中的病毒载量，并且在感染后21天检测不到病毒(图7D)。这表明FeCocktail蛋白免疫加速了PRRSV从血液中的清除，缩短了病毒血症的持续时间。

随后，作者从攻毒仔猪身上收集肺组织样本进行组织病理学染色。结果显示FeCocktail蛋白免疫可显著减轻肺组织损伤，肺间质形态变化不明显(图7E和图7F)。此外，FeCocktail蛋白免疫仔猪肺组织中的病毒载量也显著低于PBS免疫仔猪肺组织中的病毒载量(图7G)。这些结果表明FeCocktail蛋白对仔猪同源PRRSV具有保护作用。

图7. FeCocktail疫苗对仔猪的保护性免疫

在这项研究中，作者开发了新的多表位重组蛋白抗原，并测试了它们作为PRRSV疫苗的有效性。利用SpyCatcher-SpyTag系统将重组蛋白展示在铁蛋白纳米颗粒表面，并与佐剂联合免疫小鼠和猪。作者的研究证实，重组纳米颗粒在接种疫苗的动物中有效地引发了强大的特异性细胞免疫反应，并对同源PRRSV毒株提供了免疫保护。总之，作者的研究结果为研制通用PRRSV疫苗奠定了基础，并为下一代疫苗的设计策略提供了有价值的见解。