肉及肉制品微生物检测新技术研究进展

肉及肉制品富含蛋白质、脂类、维生素以及铁、锌等矿物质，是优质动物蛋白的重要来源，同时我国肉及肉制品产量巨大，近10年肉类平均年产量近8505万t，其中肉制品产量占15%～20%，其食用安全性备受人们关注。本文介绍肉及肉制品中微生物限量要求，分析传统微生物检测方法的弊端，综述快速测试片法、三磷酸腺苷（ATP)生物荧光法、分子诊断法、免疫分析法、光谱法及仪器法等新技术在肉及肉制品微生物检测应用中的研究进展。

一、我国肉及肉制品相关标准中微生物限量要求

肉及肉制品的营养成分适宜微生物的生长繁殖，微生物数量也是肉及肉制品相关标准中的重要卫生指标和安全指标，相关标准中对微生物的限量要求如表1～2所示。

由表1～2可知，对肉及肉制品有限量要求的微生物种类包括菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌(O157：H7）、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和单核细胞增生李斯特氏菌，其中菌落总数和大肠菌群代表产品的卫生情况，在鲜牛肉、肉松、肉脯、火腿肠、熏煮火腿、熏煮香肠等产品标准中为出厂检验指标，每批次均需检验合格后方能出厂。

二、传统微生物检测方法

传统微生物检测采用食品安全国家标准食品微生物检验4789系列标准，如GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》、GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、GB 4789.6—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》、GB 4789.36—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验》、GB 4789.5—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》、GB 4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》、GB 4789.11—2014《食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验》及GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。

通常需提前配制稀释管、培养基，对使用的稀释管、培养基和相关耗材进行高压灭菌，经样品处理、稀释、加样、培养、计数等环节才能得到检测结果，通常需2d以上，操作费时费力。为能得到准确结果的同时缩短检测时间、降低检测成本，研究人员开发了新型的微生物检测技术。

三、肉及肉制品微生物检测新技术

1.快速测试片法

快速测试片法是将培养基系统预先制备在测试片上，微生物菌落在测试片上呈红色或粉红色，可增强微生物计数效果。

赵立冬等分别使用快速测试片法与GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》检测熟肉样品、人工污染熟肉样品的菌落总数结果一致性，发现2种方法检测结果相关系数分别为0.897、0.964，检测结果一致性较好。快速测试片法与传统的平板计数法原理相同，但该方法无需提前配制培养基、稀释液，检测步骤较少、效率高，培养时间仅需24 h，可大幅节省检测时间，同时可节省菌落总数检测过程中的时间和人力成本，目前已形成成熟的商业化产品。

2.ATP生物荧光法

ATP广泛存在于生物活体内，且每个微生物活菌细胞中均有含量近似的ATP，荧光素酶是一种生物活性催化剂，可将ATP的化学能转化为光能。ATP在具备荧光素酶、氧气、镁离子的环境中可与荧光素反应产生荧光，荧光强度与ATP含量呈线性关系，通过检测生物荧光即可间接获得菌落总数。

3.分子诊断法

（1）多重实时聚合酶链式反应（PCR）法

多重实时PCR是在常规PCR的基础上加入多对特异性引物，通过DNA聚合酶催化及碱基配对实现对引物界定的DNA样品中不同序列扩增，具有检测通量高、灵敏度高、成本低等优势，近年来发展迅速。Elisa等利用多重实时PCR方法同步检测肉制品中沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7和单核细胞增生李斯特氏菌，若样品中只含有这3种致病菌中的一种，则检测限可达10 CFU/g，若样品中有3种致病菌，则检测限为10CFU/g。多重实时PCR检测微生物，尤其是致病菌的高灵敏度是建立在增菌培养处理的前提下，增菌时间越长，灵敏度越高，实际检测过程中需根据样品情况在检测时间和检测限二者间进行平衡。

（2）等温扩增技术

等温扩增技术仅需简单的恒温仪器既可实现核酸体外扩增，已成为PCR扩增技术的替代性选择，包括环介导等温扩增、滚环扩增、单引物扩增等技术，Ledlod等开发了基于环介导等温扩增技术和双向侧流试纸相结合的方法，可在45 min内快速检测肉品中单核细胞增生李斯特氏菌，检出限达20 CFU/g 。等温扩增技术的缺点在于对引物设计的要求较高，同时易形成气溶胶，造成假阳性，影响检测结果。

4.免疫分析法

（1）胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是一种以胶体金作为标记物应用于检测特定抗原或抗体的一种新型免疫标记技术。胶体金在弱碱性环境下带负电荷，可与带正电荷基团的蛋白质分子、伴刀豆球蛋白A、植物血浆凝集素、萄球菌A蛋白等生物大分子结合，在显微镜下呈黑褐色，若有大量结合物聚集则用肉眼即可观察到粉红斑点，可用于定性或半定量的快速免疫检测。胶体金免疫层析技术的缺点在于无法实现高通量检测，且其准确性高度依赖抗体的特异性。

（2）荧光量子免疫试纸条法

荧光量子表面具有不同的官能团，通过修饰即可与抗体等生物大分子偶联，同时荧光量子点具有稳定性好、荧光强度高等特点，可提高免疫层析试纸条的灵敏度和稳定性。荧光量子免疫试纸条法的缺点在于检测限较高，目前仍无法满足肉制品中致病菌的检测限量要求。

5.光谱检测

（1）近红外光谱法

近红外光谱波长为780～2526 nm，是介于可见光与中红外光之间的电磁波，可反映分子化学键基频振动的倍频和合频吸收，结合化学计量学方法（如偏最小二乘法）可实现快速、无损、多组分同步检测含氢官能团的有机物，已广泛应用于猪胴体、鲜猪肉、鲜牛肉及冻牛肉、鲜羊肉、鲜鸡肉、羊肉卷、牛肉汉堡饼等肉及肉制品的检测。

（2）表面增强拉曼光谱法

光束照射到物体表面时出现的少部分折射光方向和波长均发生变化的散射为拉曼光谱。不同的被照射物质分子中的官能团各不相同，由此产生振动的拉曼光谱可提供分子结构信息，从而实现对被照射物质的快速检测。但是拉曼光谱易受干扰，导致信号较弱，通过贵金属表面糙化处理可使拉曼信号增强，这种现象被称为表面增强拉曼，可实现痕量物质的快速检测。拉曼光谱也可反映肉中蛋白质结构变化，从而反映肉的腐败变质程度。

（3）高光谱成像技术

高光谱成像技术是一种光谱和图像融合的光电检测技术，能同时反映样品内外部的信息，光谱波段覆盖了紫外、近红外、可见光区域，分辨率可达纳米级别，是一种融合光学、计算机、信号处理学的检测技术。光谱法对肉及肉制品中有机物含量有较好的预测效果，同时具有一定的定性判别能力，但目前光谱类设备价格较高，未开发出针对不同产品基质的微生物检测专用设备，且多为预测方法，仍需对其预测准确性进行大量验证才可进行实际应用。

6.仪器法

（1）流式细胞术

流式细胞术是融合流体力学、激光学、荧光染色科学和计算机科学的细胞分析技术，具有快速、多指标、分析全面等特点65。随着流式细胞术在各领域中的应用越来越多，商品化的流式细胞仪也越来越成熟。微生物通常由分析型的流式细胞仪检测，该设备包括液流系统、光路检测系统和检测分析系统，将待测样品制成单细胞悬液，经液流系统进入光路检测系统，细胞在激光照射下发生散射和折射，产生的散射光信号和荧光信号由不同的通道接收，经计算机分析处理得出检测结果。流式细胞术的缺点在于只能对细胞等生物分子进行分析检测，肉及肉制品等食品中不同基质需使用不同的荧光染料标记，存在荧光信号重叠的可能性，会降低检测准确性。

（2）电化学法

微生物在培养过程中，生理代谢作用使培养基的电惰性物质（如碳水化合物、类脂、蛋白质）转化为电活性物质，大分子物质转化成小分子物质，体系的阻抗降低，因此可以通过测定体系中电流或电位的变化规律，构建电流或电位与微生物浓度的关系模型，进而测定出体系中微生物的浓度。这种方法具有测定快速、直观、操作简单、测定设备成本低和信号可控等特点。