153-2012-0258
Daniela Cavalleri1 , Martin Murphy1 , Wolfgang Seewald1 , Jason Drake2* and Steve Nanchen1
礼蓝（上海）动物保健有限公司
摘要：
【背景】乐替拉纳(可立奥)是新型异噁唑啉化学类的最新成员，被开发用于治疗犬的体外寄生虫感染。口服乐替拉纳可迅速吸收，并在用药后2小时内达到血药浓度峰值。进行了一项研究，以确定乐替拉纳对已感染跳蚤的最快起效速度。
【方法】从72只比格犬中，64只符合条件的犬按照第-8天的跳蚤数量降序排列，并被放置在8个区块中。每组8只犬，随机分为8组:第1 ~ 4组在喂食后30(±5)min内口服乐替拉纳，剂量尽量接近20 mg/kg的最小剂量;第5 ~ 8组为未经治疗的对照组。第-2天所有犬感染(100±5)只跳蚤，分别于治疗后30 min、1、2、8 h进行全身跳蚤计数。如果同等对照组中有足够的跳蚤感染(8只未接受治疗的犬中至少6只犬的跳蚤滞留≥50%)，则根据算术和几何平均值计算疗效。
【结果】所有对照组犬均有足够的跳蚤感染。在给药后30分钟和1小时，与匹配的未处理对照组相比，乐替拉纳处理组的平均跳蚤数量没有显著减少，但在治疗后1小时有明显的濒死的跳蚤。治疗后2 h，与等量对照组相比，乐替拉纳组几何平均蚤数减少64.0% (t(7) = 2.86, P = 0.0242)。治疗后8小时，乐替拉纳有效率为99.6%。未发生与治疗相关的不良事件。
【结论】本研究表明，犬对乐替拉纳咀嚼片具有良好的耐受性，并在治疗后2小时内开始杀死跳蚤，8小时内达到99.6%的杀灭效果。因此，乐替拉纳可用于快速缓解现有跳蚤感染引起的刺激。
【关键词】跳蚤，猫栉首蚤，乐替拉纳，可立奥，杀灭速度，犬，口服
背景
自20世纪90年代中期非泼罗尼滴剂和吡虫啉产品推出以来，对已感染跳蚤的杀灭速度（SOK）一直是任何新的防蚤产品的一个理想特征。这一特征的重要性是因为可以缓解跳蚤叮咬犬引起的刺激，宠物主人对产品性能肯定，并迅速切断跳蚤产卵来源[1]。在滴剂出现之后，口服治疗显示出更快的活性，烯啶虫胺和多杀菌素在给药后4小时内均显示出100%的有效性[1-3]。
最近，口服的异噁唑啉已成为快速起效的产品，对于已经感染的跳蚤的杀灭速度及效果，迄今为止还没有一种药物能与早期口服产品相媲美。一项比较沙罗拉纳和阿福拉纳的研究表明，当在治疗后8和12小时计数完成时，两种产品对跳蚤感染的疗效都>99%[4]。另外两项研究表明，沙罗拉纳、氟雷拉纳和多杀菌素/米尔贝肟组合在治疗后8h的有效率为100%[5,6]。治疗后3小时，多杀菌素的有效率在两项研究报告中分别为86%和93%，而在同一研究中，异噁唑啉(阿福拉纳)在同一时间点的有效率为3%-26%[7]。
乐替拉纳是一种新型异噁唑啉药物，对跳蚤和蜱快速起效，并可在治疗后35天持续有效。在一系列研究中，乐替拉纳在治疗后4小时对已感染跳蚤的效果为89.9%，8和12小时为100%。在治疗后的一个月里，4小时的疗效保持在＞97%，在6、8小时维持＞99%，12小时保持在100%[8]。由于乐替拉纳迅速被吸收，并在治疗后2小时内达到血药浓度峰值，因此研究人员对确定治疗后跳蚤多快开始死亡很感兴趣[9]。因此，我们设计了一项额外的研究，以进一步了解乐替拉纳在用药后非常早期的时间点，其对犬身上已感染的猫栉首蚤SOK。
方法
将犬分配到各研究组后，除参与治疗外的所有实验操作人员均不知晓分组情况。
试验犬和饲养管理
研究犬的纳入标准是:性格温顺，配合度高，允许跳蚤感染和计数顺利完成;临床健康且未怀孕;没有任何跳蚤过敏皮炎的迹象;至少七月龄。在适应期开始时，体重在8.9-19.6 kg之间。在第0日(治疗日)之前的12周内，犬不能接受具有抗跳蚤活性的长效局部或全身产品治疗，在过去6个月内也不能接受含有异噁唑啉的产品治疗。
年龄9个月至9岁，体重9.2-18.2 kg的比格犬在乐替拉纳给药前9天适应环境。犬单独饲养在笼子里，犬之间不可能有身体接触。笼子在室内，动物单位环境可控温度,这包括在研究期间16.1°C到22.9°C。光周期为12 h:使用头顶荧光灯维持12 h黑暗。我们给犬按照制造商推荐的量喂食了商业上可行的适龄饲料(VetsBrands Premium adult)，用不锈钢碗盛水，每天至少补充两次。第-8天，72只犬每只染蚤约100只。24 h后对犬进行梳理，进行蚤数计数。选取染蚤数最高的64只符合条件的犬纳入研究。
治疗
研究中纳入的64只犬按照第8天染蚤数的降序排列，并被分为8个组，每组8只犬。
1-4组接受了口服乐替拉纳的治疗，尽可能地接近最小推荐剂量20mg/kg，并在饲喂后30（±5）分钟内进行。而5至8组是未接受治疗的对照组，意味着它们没有接受任何治疗。给予乐替拉纳治疗的每只犬在给药后立即进行观察，以及在给药后30（±5）分钟和1小时（±10分钟）进行观察。这些观察由非盲的人员进行。对照组的犬被从笼子中取出并放置在给药台上进行虚假治疗，这样做的目的可能是确保在治疗组和对照组之间进行类似的处理，以及为后续治疗活动建立一个参考时间。在整个研究期间，对所有犬进行了至少每天一次的健康观察。
跳蚤感染和计数
每只犬在 -8 天（用于选择和随机化）和 -2 天接受了约100只未进食的成年跳蚤的感染。所有感染所使用的跳蚤来自 实验室繁育的猫栉首蚤群体（美国品系）。跳蚤的计数和清除如下进行：1组和5组在治疗后30分钟；2组和6组在治疗后1小时；3组和7组在治疗后2小时；4组和8组在治疗后8小时。为了收集跳蚤，每只犬使用梳子进行至少5分钟的梳理，梳子沿着犬身体的每个部位进行滑动，并且每次都朝相同的方向移动，遵循毛发的方向。从犬的一部分移动到另一部分时，梳理通过重叠的方式进行，以确保没有遗漏任何区域。然后重复该过程，直到所有犬至少被完全梳理两次为止。如果第二次全身梳理后跳蚤仍然存在，则再次重复该过程，直到没有活跳蚤或濒死的跳蚤为止。
梳下来的跳蚤被分为活跳蚤、濒死的跳蚤和死亡的跳蚤。活跳蚤指的是能够在毛发间活动，并且当放置在平坦的表面上时，能够快速翻正自己并迅速移动或跳跃的跳蚤。濒死的跳蚤指的是侧卧且不能正常在毛发间活动，也不能自行翻正，但仍然有腿部运动或抖动。死亡的跳蚤指的是完全不动的跳蚤。
功效评估
对每个时间点上乐替拉纳对跳蚤的功效，根据以下公式进行计算：效力（%）= 100 × （Mc - Mt）/ Mc，其中Mc是未经处理的对照组（第5至第8组）在第0天活跳蚤的平均数量，Mt是对应乐替拉纳组（第1至第4组）在第0天活跳蚤的平均数量。效力计算基于算术平均值和几何平均值。几何平均值使用跳蚤（计数+1）的数据进行计算，然后结果中减去1。
乐替拉纳被认为开始杀灭跳蚤的时间点，是指几何平均活跳蚤计数与未经处理对照组相比，出现统计学意义上的显著减少，并且存在递增的效力，最终达到至少90%的时间点。如果在给定时间点对照组中获得了足够的感染（至少有六只犬中有50%的跳蚤保留），并且在两组之间的跳蚤计数中存在统计学上的显著差异（α = 0.05），与对照组相比治疗组的存活跳蚤数明显减少，那么乐替拉纳在给定时间点就被认为是有效的。统计单位是各只个体犬。
结果
给予的乐替拉纳剂量范围为20.5至29.1 mg/kg。然而，最高剂量（在第1组的一只犬-治疗后30分钟）超过了目标剂量，因此这只犬被排除在计算之外，以避免结果对于任何与更高剂量相关的速效杀灭结果产生偏差。在剩下的犬中，最大剂量为24.7 mg/kg。对照组（第5至第8组）在所有评估时间点均达到了感染的充分性要求，因为每组八只犬中有六只以上的跳蚤保留率≥ 50%，平均活跳蚤计数范围为76.9只至88.8只。
尽管治疗后30分钟，乐替拉纳组的平均跳蚤计数数值上低于对照组，但与对照组之间没有显著差异(t(6)=1.84, P = 0.1152)，并且只有一只濒死的跳蚤被发现在一只受治疗的犬身上（表1）。在治疗后1小时，乐替拉纳组的平均跳蚤计数没有减少。在此评估中，从五只乐替拉纳组的犬身上收集到了22只濒死的跳蚤，而对照组中的一只犬身上只发现了一只濒死的跳蚤（表1）。治疗后2小时，与对照组相比，乐替拉纳组的几何平均跳蚤计数减少率为64.0% (t(7)=2.86, P = 0.0242)（算术平均计数减少率为50.3%）（表2）。此计算包括在两小时后评估唯一有100只跳蚤的受治疗犬，其中没有一只跳蚤是濒死的，而其他七只犬中共移除了105只濒死的跳蚤。第0天时在治疗8小时后，乐替拉纳的功效几何平均值为99.6% (P ＜ 0.0001)，没有任何跳蚤被分类为濒死，所有梳下的跳蚤都已经死亡。此时，跳蚤计数减少率算术平均为98.8%。
除了在两只受治疗的犬和两只对照组的犬身上观察到皮肤干燥和鳞屑外，没有其他不良事件发生。这些症状也在治疗前的四只不同研究犬身上观察到，这些症状被归因于跳蚤感染和跳蚤梳理引起的。
表1.未处理对照和乐替拉纳处理犬的第0天跳蚤计数，濒死跳蚤被算作死亡或纳入活跳蚤计数(濒死跳蚤被算作活蚤)
表2.乐替拉纳处理的犬的平均跳蚤计数减少百分比，濒死的跳蚤被算作死亡或包括在活的跳蚤计数中(濒死的跳蚤被算作活的跳蚤)
讨论
当将这项研究的结果与其他研究结合起来评估时，乐替拉纳显现出快速杀跳蚤活性。在这项研究中，治疗后1小时观察到乐替拉纳组的22只濒死跳蚤的现象表明乐替拉纳起效早。治疗后2小时，濒死跳蚤的数量大幅增加，并且受治疗犬身上的活跳蚤数量显著减少（有效率为64.0%；t(7) = 2.86，P = 0.0242）。在另一项研究中，治疗后4小时相对于未接受治疗的对照组，活跳蚤计数总体减少了89.9%，由于此时跳蚤死亡率较高，只有少量濒死跳蚤存在[5]。在另一项研究中，治疗后6小时，活跳蚤计数平均减少了99.2%[8]（图1）。
图1.5项不同研究的综合结果显示，乐替拉纳对跳蚤的功效是基于接受治疗的犬的几何平均值进行比较。与未接受治疗的对照组进行比较。相同颜色的列表示单个研究。目前的研究在2和8小时是蓝色的;另一项研究评估了6小时时间点，一项研究评估了8小时时间点。两项研究评估了12小时时间点
这种活性与药代动力学研究中报道的乐替拉纳的快速吸收相吻合，在该研究中，在口服给药后30分钟内，大多数受治疗的犬的血液中可检测到乐替拉纳。治疗后大约2小时达到血药浓度峰值[9]。因此，在按剂量给予后，几乎任何吸血的跳蚤都会迅速接触到乐替拉纳。
在乐替拉纳的2小时组中，那只有100只活跳蚤（其中无一只是濒死的）的犬可能是给药药片被立即突出来的关系。然而，由于无法明确证明，这只犬的跳蚤计数被包括在组分析中。尽管包括了这只犬的数据，但与对照组相比，几何平均跳蚤计数减少的百分比（64.0%）是显著的（P = 0.0242）（算术平均减少为50.3%）。
这些结果与另外四项研究的报告一致，其中在治疗后4小时对已感染跳蚤的杀灭率为89.9%，治疗后6小时为99.2%，治疗后8小时为99.9%，治疗后12小时为100%（图1）[5]。在治疗后4小时和随后感染完成的评估中，一月内SOK保持在99%以上。在两项研究中，在治疗后12小时和每个治疗后再感染的情况下，至第35天的功效为100%。乐替拉纳这种持续的快速杀跳蚤能够减少或消除随后的再感染可能引起的烦恼，并会在产卵开始之前导致跳蚤死亡。
在设计本研究的方案和统计分析计划中，作者注意到了欧洲和美国监管机构在关于濒死跳蚤是否应被视为活的或死的问题上的不同方法[10]。我们已经提供了两种格式，但在疗效评估中，我们将濒死的跳蚤视为死亡有两个原因。首先，根据定义，濒死表示跳蚤无法进食，无论它们是否仍停留在犬身上，它们都会死亡。其次，如果濒死的跳蚤从受治疗的犬身上掉下来，它们将不会处于适合感染同一或不同寄主的状态。寄主的感染发生在环境中的幼虫阶段出现并找到新的寄主时。只有很小一部分的跳蚤在动物之间转移[11]，而且没有记录显示从一个寄主掉下来的跳蚤能够找到并感染新的寄主，尤其是如果这些跳蚤在从初始寄主身上掉下来时已经处于濒死状态。
结论
本研究证明了犬对乐替拉纳的耐受性良好，并且在治疗后2小时内开始杀灭跳蚤，从而成为第一种接近多杀菌素SOK的异噁唑啉产品。这种杀虫的快速起效应该能够迅速缓解由现有感染引起的跳蚤刺激。
文章来源：Cavalleri et al. Parasites & Vectors (2017) 10:521
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